一种快速测定水样中微囊藻细胞数目的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速测定水样中微囊藻细胞数目的方法，包括如下步骤：（1）取若干个与待测水样处于同一水域的测试水样，测量测试水样中的β-环柠檬醛浓度和微囊藻细胞数目，直线线性回归拟合得到该水域β-环柠檬醛浓度与微囊藻细胞数目的标准曲线；（2）取待测水样，测量待测水样中的β-环柠檬醛浓度，根据所述的标准曲线，计算得到待测水样中的微囊藻细胞数目。本发明专利技术提供的快速测定微囊藻细胞数目的方法，无需任何前处理，检测过程方便快捷，成本较低，当湖泊、水库、河流等地表水发生水华时，可用该法测定该水域多个区域的微囊藻细胞数目，并判断水华是否由微囊藻引起。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及饮用水源的环境监测与保护
，具体涉及采用￠-环柠檬醛为技术指标快速鉴别水样中微囊藻的存在和测定其数量的方法。
技术介绍
随着经济的迅速发展，到20世纪90年代后期，在我国已调查的湖泊中，有88. 6%处于富营养状态。进入21世纪，湖泊富营养化呈现高速发展的态势。目前我国已经发生富营养化的湖泊面积达5000km2，具备发生富营养化条件的湖泊面积达到14000km2。由于富营养化水体面临频繁暴发淡水藻水华的问题，因此，以富营养化水体作为饮用水源，会对我国居民的饮水安全造成严重威胁。 在淡水湖泊富营养化引起的水华中，以春夏季微囊藻水华最为常见，如我国的太湖流域，微囊藻的生物量占藻类总生物量的90%以上；滇池的微囊藻水华常年不消退，水质腐败，藻毒素含量居高不下。随着水体污染的加剧，越来越多的湖泊、水库甚至河流也时常暴发水华现象，因此，需要辨别富营养化水体的水华是否由微囊藻引起以及确定微囊藻的数量。目前鉴别微囊藻种类和数量的常用方法是光学显微镜计数法和聚合酶链式反应法(PCR)。前者通过检测者直接观察辨别藻细胞的种类，并进行计数，耗费时间和体力较大，尤其是水样较多时；后者测量精准，但成本较高，操作繁琐。因此，需要找到一种简便快捷的方法对引起水华的藻类及其数量进行快速判断，在第一时间掌握水华暴发的数据资料，为水环境的应急处理提供基础。￠ -环朽1 樣醒(2，2，6-trimethyl-l-cyclohexene-l-carbonxaldehyde, ^ -cyclocitral)属于微囊藻的代谢物，由微囊藻细胞内的￠-胡萝卜素在胡萝卜素加氧酶的催化下，被氧气氧化发生断键反应形成。3 -环柠檬醛是一种挥发性有机物，在不同浓度下(0. 5^80 u g/L)嗅味描述不同，当浓度低于I y g/L时，为新鲜的青草味；当浓度为2 10 u g/L时，为干草味或木头味；当浓度大于IOy g/L时，为类似烟草的味道。目前普遍认为￠-环柠檬醛具有专属性，只有微囊藻能产生，因此可以通过检测3 -环柠檬醛的浓度得到微囊藻的细胞数量。
技术实现思路
本专利技术提供了，以微囊藻的特有产出物@ -环柠檬醛为指标，利用固相微萃取和气相质谱测定水中微囊藻的细胞数目，该方法在采样后能快速得到检测结果，无需前处理，方便快捷，成本低廉。—种快速测定水样中微囊藻细胞数目的方法，包括如下步骤(I)取若干个与待测水样处于同一水域的测试水样，测量测试水样中的￠-环柠檬醛浓度和微囊藻细胞数目，直线线性回归拟合得到该水域P -环柠檬醛浓度与微囊藻细胞数目的标准曲线；(2)取待测水样，测量待测水样中的￠-环柠檬醛浓度，根据所述的标准曲线，计算得到待测水样中的微囊藻细胞数目。所述的待测水样与测试水样取于同一时段内所述水域的不同区域，或不同时段内所述水域的同一区域，或不同时段内所述水域的不同区域。测量测试水样中的0 -环柠檬醛浓度和微囊藻细胞数目，通过线性拟合得到该水域@ -环柠檬醛浓度与微囊藻细胞数目的标准曲线，该标准曲线线性良好，适用于该水域不同区域以及与建立所述标准曲线的微囊藻处于同一生长周期的微囊藻细胞数目的测量。由于微囊藻喜温和阳光，一般聚集在水体表面，因此最好采集水面以下0. 5m处的 水作为样本，采样时也可以为其他水深位置，但同一水域的采样水深应相同。所采集的水样不少于IOOmL,且采集瓶上方不留空气，4°C环境保存，并尽快检测，防止保存过程中微囊藻数目发生改变和3 -环柠檬醛的挥发，影响检测结果。作为优选，所述步骤(I)中测量测试水样中￠-环柠檬醛浓度的方法为利用固相微萃取收集测试水样中微囊藻细胞产生的全部3 -环柠檬醛，使用气相质谱法测量￠-环柠檬醛浓度。固相微萃取利用萃取纤维萃取水样，进行气相质谱检测集采样、萃取、浓缩、进样于一体，进样空白值小，甚至可以忽略，萃取纤维可以重复使用50次以上，成本较低。本专利技术中如无特殊说明，测量￠-环柠檬醛浓度时用的气相质谱条件为进样口温度180°C ;柱压为90kPa ;毛细管柱升温程序为初始温度40°C，恒定3min后，以8°C /min的速度升温至120°C，再以15°C /min的速度升温至250°C，恒定2min ;与质谱接口温度为2500C ;离子源温度为200°C ;不分流进样；选择离子检测模式；离子源为EI (电子电离)。作为优选，所述的气相质谱内标物为2-异丁基-3-甲氧基吡嗪。￠-环柠檬醛的特征质荷比为137和67，2-异丁基-3-甲氧基吡嗪的特征质荷比为124和94，以2-异丁基-3-甲氧基吡嗪(IBMP)为内标，利用气相质谱建立P -环柠檬醛的标准曲线，可以保证标准曲线具有较高的线性相关系数和重复性。本专利技术中如无特殊说明，气相质谱样品中2-异丁基-3-甲氧基卩比嗪的最终浓度为20ng/L (lng=10_9g)。作为优选，在测试水样中加入2-异丁基-3-甲氧基吡嗪和氯化钠后进行固相微萃取。在水样中加入氯化钠，可以加速微囊藻细胞的破裂，使微囊藻细胞内的￠-环柠檬醛全部释放出来，同时，氯化钠还可以提高溶液的极性，促进3 -环柠檬醛和2-异丁基-3-甲氧基吡嗪的挥发。作为优选，所述的测试水样与氯化钠的比例为IOmL 3 4g，即可使测试水样中微囊藻细胞全部破裂，同时利于萃取。作为优选，所述步骤(I)中测量测试水样中微囊藻细胞数目的方法为显微镜计数法，利用显微镜计数法可以直观快速得到微囊藻细胞数目。作为优选，所述的显微镜计数法使用的固定染色试剂为含冰醋酸的卢戈氏试剂。含冰醋酸的卢戈氏试剂中各组分KI、I、冰醋酸以及蒸馏水的比例为2g : Ig : 2mL : 20mLo微囊藻的固定是指在酸性条件下，微囊藻的繁殖受到限制，在后续静置及观察过程中，微囊藻的数目不会发生改变，用冰醋酸调节溶液的PH至酸性，即完成了微囊藻的固定。经所述含冰醋酸的卢戈氏试剂固定和染色后，可以在显微镜下清楚辨别微囊藻细胞，提高计数的准确性。染色完成后，取适量染色后的溶液，置于藻类计数框内，静置一段时间后，用显微镜观测计数，计数重复至少两次，使得到的微囊藻细胞数目计数误差在可接受的范围内。作为优选，所述测试水样和待测水样中P -环柠檬醛的浓度的检测范围为10 20000ng/L。若微囊藻液浓度过高导致P -环柠檬醛浓度超过检测范围，需要用Mi II-Q超纯水进行适当稀释后进行检测。根据我国太湖流域、长江流域和实验室培养的藻种测定，微囊藻细胞能产生IOOfg(lfg=10_16g)左右的￠-环柠檬醛，￠-环柠檬醛的检测限为10ng/L，相应微囊藻细胞数目的检测限为105cell/L，低于暴发水华时，水体中微囊藻细胞数目的最小值106cell/L。如果气相质谱无法检测到￠-环柠檬醛，则可以认为水华不是由微囊藻引起的。由于不同水域，微囊藻种类会有所差异，需取若干个与待测水样处于同一水域的测试水样，测量该测试水样中的3 -环柠檬醛浓度和微囊藻细胞数目，直线线性回归拟合得到该水域P -环柠檬醛浓度与微囊藻细胞数目的标准曲线，该标准曲线的斜率即该水域单颗微囊藻细胞的3-环柠檬醛生产量，再通过测定3-环柠檬醛浓度即可计算得到相应的微囊藻细胞数目，该标准曲线适用于该水域其他检测点以及与建立标准曲线的微囊藻处于同一生长周本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速测定水样中微囊藻细胞数目的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)取若干个与待测水样处于同一水域的测试水样，测量测试水样中的0-环朽1檬醒浓度和微囊藻细胞数目，直线线性回归拟合得到该水域0 -环柠檬醛浓度与微囊藻细胞数目的标准曲线; (2)取待测水样，测量待测水样中的3-环柠檬醛浓度，根据所述的标准曲线，计算得到待测水样中的微囊藻细胞数目。2.如权利要求I所述的快速测定水样中微囊藻细胞数目的方法，其特征在于，所述步骤(I)中测量测试水样中￠-环柠檬醛浓度的方法为利用固相微萃取收集测试水样中微囊藻细胞产生的全部3 -环柠檬醛，使用气相质谱内标法测量3 -环柠檬醛浓度。3.如权利要求2所述的快速测定水样中微囊藻细胞数目的方法，其特征在于，所述气相质谱内标法米用的内标物为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张可佳，李聪，张土乔，张仪萍，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：