本发明专利技术提供了特异性结合禽流感病毒(AIV)H5亚型的包膜糖蛋白的单克隆抗体及相关的结合蛋白。上述单克隆抗体及相关的结合蛋白可用于检测AIV的H5亚型，包括致病性H5N1亚型。病毒可以在福尔马林防腐的、石蜡包埋的样品以及冷冻样品和生物学液体中检测。因此，本发明专利技术提供了诊断和监视危险的病毒感染的方式方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测禽流感病毒(AIV)的抗体及相关的结合蛋白。更特别地，本专利技术涉及可用于检测AIV的高致病性H5亚型的单克隆抗体及相关的结合蛋白，以及涉及诊断和监视动物和人体内这种AIV感染的方法和制品。
技术介绍
禽流感是禽类常见疾病。AIV亚型H5N1已经在世界的许多地区导致不断蔓延的禽流感爆发(14)1。受影响的区域包括欧洲、中东，特别是亚洲。根据世界卫生组织(WHO)报 告，自2006年4月以来，大约100人死于H5N1禽流感，而且情况似乎正在恶化。见WHO网站(11)。虽然AIV感染罕见于人体，然而在过去能穿过物种屏障的新AIV亚型的出现已经导致流行性致死性流感(2，8，10)。流感病毒根据其核蛋白和基质蛋白抗原特异性分类。这些病毒主要被分为甲(A)、乙(B)、丙(C)血清型，甲型具有编码10种病毒蛋白的8个RNA节段。所有已知的甲型流感病毒均源自禽类。这种病毒可以影响其它物种，如马、猪、猫头鹰和海豹，以及对人类造成威胁(22)。根据包膜糖蛋白的抗原性质，甲型流感病毒被进一步分为亚型，根据血凝素(HA)分为H1-H16，根据神经氨酸酶(NA)分为Nl-N9(10，12，19)。确认在HA1-HA2连接处的HA蛋白的蛋白酶解与禽类品系中的致病性相关，且在这个裂解位点周围的疏水性氨基酸的存在是H5亚型的特征。此外，确认HA蛋白介导sialoside受体附着于宿主细胞，且随后通过膜融合方式进入宿主细胞(17)，并且认为HA蛋白作为中和抗体的主要靶位(19)。本专利技术涉及特异性结合AIV的单克隆抗体及相关的结合蛋白。单克隆抗体(mAb)是衍生自一种产生抗体的细胞的一群基本均质的抗体。因此该群中的所有抗体均相同，且对于指定表位具有相同特异性(5)。mAb应答的特异性提供了有效诊断试剂的基础。也发现了衍生自其中的单克隆抗体和结合蛋白作为治疗剂的用途。由于AIV感染对野生动物、驯养动物和人造成危险，因此迫切需要检测组织样品中的病毒的快速、特异性及可靠的方法。特别地，检测保存的样品中病毒的能力对于诊断疾病和监测疾病进展的能力很重要，所述保存的样品例如是福尔马林固定的包埋于石蜡中的冷冻切片样品。迄今为止，还未有关于使用H5亚型单克隆抗体诊断高致病性H5N1AIV毒株的有效方法的报道。因此，本专利技术在H5N1及其它H5毒株的诊断和监视中取得突破。专利技术概述根据本专利技术，提供了特异于H5-亚型血凝素糖蛋白的线性和构象表位的单克隆抗体及相关的结合蛋白。线性H5表位的mAb能以良好的特异性和灵敏性检测变性样品如福尔马林固定的组织样品中的病毒，而靶向构象表位的那些抗体可用于检测冷冻样品及其它生物学液体中的病毒。特别地，称作7H10的mAb靶向血凝素的线性表位，且已经证实对于福尔马林固定的组织中的病毒抗原具有高效及灵敏性，而对于冷冻的组织切片具有较小的作用。称作6B8的mAb靶向构象血凝素表位，且能结合及识别未经预处理的组织如冷冻组织样品及其它生物学组织和液体中的病毒抗原。称作8F10和2D10的单克隆抗体也靶向构象血凝素表位且提供与mAb 6B8相似的应用。因此,本专利技术包含这样的结合蛋白，其基本具有如mAb 7H10对于线性H5亚型血凝素表位的免疫学结合特性。本专利技术进一步包含这样的结合蛋白，其基本具有如mAb 6B8、8F10或2D10对于构象H5亚型血凝素表位的免疫学结合特性。另一方面，本专利技术包含检测样品中H5亚型的方法，包括检测AIV与基本具有mAb7H10的免疫学结合特性的mAb或结合蛋白的结合。再一方面，本专利技术包含检测样品 中AIV的方法，包括检测AIV与基本具有mAbmAb 6B8、8F10或2D10的免疫学结合特性的mAb或结合蛋白的结合。特别地，本专利技术涉及利用这种结合蛋白的免疫荧光测定、免疫组织化学测定以及ELISA方法。另一方面，本专利技术涉及检测AIV的试剂盒，其包含基本具有mAb 7H10或者mAb6B8、8F10或2D10的免疫学结合特性的结合蛋白。本专利技术进一步涉及治疗H5AIV毒株如H5N1AIV毒株感染的对象的方法，包括给予这种对象有效量的一或多种基本具有mAb 6B8、8F10或者2D10的免疫学结合特性的单克隆抗体或者结合蛋白。附图简述图I :在90天期间的mAb效价分布。图I中的数据证实所述mAb在大部分期间能保持稳定。图2 :在HI测定中测量的H5亚型mAb与非H5亚型病毒和H5亚型病毒的交叉反应性。各个病毒的血清抗体效价如下所示浅阴影，无HI活性；深阴影->16。图3 =Western印迹分析。各个mAb与在大肠杆菌总细胞裂解物中表达的H5N1病毒的HAl蛋白的反应性。RPMI 1640用作mAb对照。图4 :在不同组织样品中信号强度分布。样品是H5N1 AVI感染的鹊鸲MagpieRobin(信号/损害在图中用箭头标示)。a)脑冷冻切片。组织与mAb 6B8—起保温。观测到作为多个红点的较大强度的阳性信号。在神经元中见到损害。b)脑冷冻切片。RPMI 1640用作mAb 6B8阴性对照。无信号可见。c)肝石蜡切片。组织与mAb 7H10—起保温。在胆管内皮可见较小损害。d)肝石蜡切片。RPMI 1640用作mAb 7H10对照。无信号可见。e)肺切片。组织与mAb 7H10—起保温。仅在上皮组织的内侧可见损害。f)肺石蜡切片。RPMI 1640用作mAb 7H10对照。无信号可见。g)肺切片。组织与mAb 7H10—起保温。在肺泡组织可见损害。h)肺石蜡切片。RPMI 1640用作mAb 7H10对照。无信号可见。i)肾石蜡切片。组织与mAb 7H10—起保温。大量高强度信号遍布于肾细胞中。j)肾石蜡切片。RPMI 1640用作mAb 7H10对照。无信号可见。k)肝石蜡切片。组织与mAb 7H10—起保温。在肝细胞中可见损害。I)肝石蜡切片。RPMI 1640用作mAb 7H10对照。无信号可见。图5 H5亚型mAb能检测2002年以来载明日期的H5N1感染的组织的信号。a)家鸦的脑组织。b)池鹭的肺组织。c)苍鹭的脑组织。 d)鸡的脑组织。图6 =AC-ELISA形式中的捕获和检测抗体的反应性。(a)使用AC ELISA检测的不同AIV亚型。当仅H5AIV产生阳性结果时示出这个检测的特异性。“N Ctrl”是阴性对照，其中无病毒加入孔中。(b)将不同的H5AIV用PBS连续稀释并在AC ELISA中检测。使用O.100作为阳性和阴性结果之间的截断值(cut-off)，可以用AC ELISA检测的H5AIV的最小量平均为大约O. 5HA单位，7H10和6B8。图7 :7H10表位的作图。A，血凝素蛋白I的示意图，示出表达不同长度HAl片段的克隆结构及其与Mab 7H10的反应性。aa，氨基酸。B，在大肠杆菌BL21中表达的12个重组融合蛋白的Western印迹。样品来自总细胞裂解物。M，标记；NC，阴性对照；HA1，全长HAl蛋白；A-K，不同的片段。C，突变株血凝素I片段的示意图，示出表达HAl片段上不同突变的克隆构建体及其与Mab 7H10的反应性。D，在大肠杆菌BL21中表达的9个重组融合蛋白的Western印迹。样品来自总细胞裂解物。M，标记；NC，阴性对照；J本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.特异性结合禽流感病毒H5亚型的包膜糖蛋白的构象表位的结合蛋白，其基本具有单克隆抗体6B8的免疫学结合特性。2.权利要求I的结合蛋白，其是单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、嵌合抗体或者人源化抗体。3.权利要求I的结合蛋白，其是单克隆抗体。4.由杂交瘤6B8产生的单克隆抗体6B8，其保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号PTA-8246。5.一种检测生物学样品中H5亚型禽流感病毒的方法，包括将该样品与权利要求1、2或3的结合蛋白或者权利要求4的单克隆抗体接触。6.权利要求5的方法，包括将该样品与特异性结合禽流感病毒H5亚型包膜糖蛋白的第二种结合蛋白接触，其中所述第一种结合蛋白是捕获结合蛋白，第二种结合蛋白是含有或缀合有可检测元件的检测结合蛋白。7.权利要求6的方法，其中所述第一种和第二种结合蛋白的至少一种是单克隆抗体。8.权利要求6的方法，其中第一种结合蛋白固定化在固体表面上。9.权利要求6的方法，其中第二种结合蛋白含有放射性原子，与荧光分子缀合，或者与酶缀合。10.检测生物学样品中H5亚型禽流感病毒的试剂盒，其包含权利要求1、2或3的结合蛋白或者权利要求4的单克隆抗体以及检测所述结合蛋白与所述包膜...
【专利技术属性】
技术研发人员：Y·F·胡，Q·Y·杜，F·和，J·HS·康，
申请(专利权)人：淡马锡生命科学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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