为真核表达的目的构建原核基因表达岛制造技术

本发明专利技术涉及用T7启动子改造原核固氮基因，使之适应于真核表达。

【技术实现步骤摘要】
为真核表达的目的构建原核基因表达岛
本专利技术涉及改造原核生物的基因调控元件，组建适于真核表达系统的表达岛。更具体地，所述原核生物的基因是固氮基因。还更具体地，所述原核生物是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae，也称肺炎克氏杆菌)。
技术介绍
固氮所有的生物都需要氮元素。在活细胞内，氮是所有氨基酸、核酸(DNA和RNA)及其他许多重要分子的主要成分。大部分生物不能直接利用大气中的氮，仅能利用氮的某种形式的化合物。形成这些化合物的过程统称为“固氮”，这时氮与其他元素结合，被“固定”在含氮的化合物中。由于全球大面积种植农作物，土壤每年因此要失去大量的氮素。如果得不到及时补充，土壤的含氮量就会下降，从而影响农作物产量。土壤可以通过两条途径获得氮素：一是施用含氮肥料，包括氮素化肥和各种农家肥料；另一是生物固氮。20世纪80年代曾有人推算过，全世界每年施用的氮素化肥中的氮素大约有8×107吨，而自然界每年通过生物固氮所提供的氮素则高达4×108吨。因此，如果能利用生物固氮的原理，让小麦、水稻等粮食作物自行固氮，则有可能大大减少对氮素化肥的需求，提高农业产量，这对解决全球性粮食问题、以及对保护全球性生态环境，都具有十分重要的意义。固氮微生物生物固氮主要由固氮微生物完成。固氮微生物分为共生和自生两大类。共生固氮微生物典型的有与豆科植物共生才能固氮的根瘤菌。自生固氮微生物则是土壤中能够独立进行固氮的微生物，主要有细菌、蓝藻(Cyanobacterium，也称蓝细菌)等。固氮细菌中，常见的有，好氧的巴斯德氏菌属(Pasteurella)、兼性厌氧的克雷伯氏菌属(Klebsiella)、以及能进行光合作用的红螺菌属(Rhodospirillum)和红硫菌属(Chromatmm，也称着色菌属)等。目前最常用于氮肥的自生固氮菌是好氧的圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)。固氮基因在固氮菌中，研究得最多最广泛的是肺炎克雷伯氏菌，它的固氮基因由17～20个nif基因组成，依次主要有：J，H，D，K，T，Y，E，N，X，U，S，V，W，Z，M，F，L，A，B，Q，它们组成以下7个操纵子(QiCheng，PerspectivesinBiologicalNitrogenFixationResearch.JournalofIntegrativePlantBiology，2008)：NifJ操纵子：包含nifJ基因NifHDKY操纵子：包含nifH、nifD、nifK、nifY基因NifENX操纵子：包含nifE、nifN、nifX基因NifUSVM：操纵子：包含nifU、nifS、nifV、nifM基因NifF操纵子：包含nifF基因NifLA操纵子：包含nifL、nifA基因NifBQ操纵子：包含nifB、nifQ基因。在所有固氮微生物中中，整个固氮系统非常保守，固氮基因也有很高的同源性。例如，根瘤菌固氮基因系统中的nif基因就与肺炎克氏杆菌的nif基因同源。肺炎克雷伯氏菌固氮基因的异源表达已有人将肺炎克雷伯氏菌24kb的nif固氮基因(NCBI登录号X13303)整个从染色体上切下来，不经分割直接连接到载体上，转化大肠杆菌(Escherichiacoli)，使本来不能固氮的大肠杆菌获得固氮能力(RayDixon，FrankCannon，ConstructionofaPplasmidcarryingnitrogenfixationgenesfromKlebsiellapneumoniae.Nature，1976)。后来，又有人尝试将同样的固氮基因转移到酵母中，但所得酵母只能合成出构成固氮酶的部分蛋白质，不具有固氮能力(AdaZamir，StablechromosomalintegrationoftheentirenitrogenfixationgeneclusterfromKlebsiellapneumoniaeinyeastProc.NatLAcad.Sci.USA，1981)。可见，将固氮基因从原核生物转移到真核生物中进行表达，使小麦、水稻等真核生物实现生物固氮，还存在很大困难。
技术实现思路
本专利技术尝试改进原核基因的表达调控机制，使之适应于真核表达。所述原核基因例如固氮基因。为了更好地理解本专利技术，作出以下解释：表达岛(expressionisland)也可以称“调控岛”，是指多个调控元件与多个基因组成的结构，其中每个调控元件可以调控一或多个基因的转录和/或表达。在原核基因的情形下，所述表达岛可以是指，一或多个带有调控元件的操纵子。在本专利技术优选的实施方案中，一方面，所述调控元件进行的调控独立于宿主固有的表达系统，既不受其影响，也不对其造成干扰；另一方面，岛内每一调控元件进行的调控独立于岛上的其它调控元件(如果有的话)，从而允许调控岛上不同基因的不同表达水平，以实现各个基因的表达产物的功能最优化。在本专利技术的表达岛中，所述调控元件优选并非所述基因或所述操纵子的天然调控元件，更优选所述调控元件是T7启动子，所述T7启动子选自：T7wt，T7M4，T7M5，T7M6，T7M7，和T7M8，以及任何其它的T7变体，所述变体具有T7启动子的活性，但强度相对于野生型而言可以有不同。在本专利技术优选的实施方案中，表达岛由BioBrick组件组成。更优选地，所述BioBrick组件是带有T7启动子的目标基因或目标操纵子，例如是带有不同的T7启动子的多个原核生物固氮基因。在一个具体实施方案中，表达岛中的多个基因选自固氮基因nifJ，nifH，nifD，nifK，nifT，nifY，nifE，nifN，nifX，nifU，nifS，nifV，nifW，nifZ，nifM，nifF，nifL，nifA，nifB，和/或nifQ。在另一具体实施方案中，所述表达岛不含固氮基因nifT，nifY，nifX，nifU，nifS，nifV，nifW，nifZ，nifL，nifA，和/或nifQ。在又一具体实施方案中，所述固氮基因是以天然操纵子的形式存在，但该天然操纵子的启动子已替换为T7启动子。在还一个具体实施方案中，所述操纵子是T7wt+nifJ，T7wt+nifHDKY，T7M5+nifENX，T7M5+nifUSVM，T7M6+nifF，和/或T7M6+nifBQ。BioBrick该术语是BioBricks基金会(BioBricksFoundation)所拥有的商标。BioBrick组件(BioBrickpart)指一种DNA序列性质的标准生物学组件，其中，每一个标准组件都具有相同的“前缀”和“后缀”，如下所示：由于具有共同的界面，BioBrick组件常常被引入诸如大肠杆菌之类的活细胞，来构建新的生物系统。因此，它们常用于合成生物学和纳米技术等领域。详情可参见例如：Knight，T.(2003)，IdempotentVectorDesignforStandardAssemblyofBiobricks.MITSyntheticBiologyWorkingGroup；Fromthecellsup，TheGuardian，10March2005；BioBrickstohelpreverse-engineerlife，EE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.构建用于原核固氮基因真核表达的表达岛的方法，包括：测定一组原核固氮基因中每一个的天然启动子的强度，依据所测定的强度，将所述启动子替换为以下T7启动子或其变体，其中所述表达岛为包含以下T7启动子或变体与以下固氮基因特定组合的表达岛：T7wt+nifJ，T7wt+nifHDKY，T7M5+nifENX，T7M5+nifUSVM，T7M6+nifF，和T7M6+nifBQ，并且其中所述原核固氮基因以天然操纵子的形式存在，其中所述T7M5是指在T7启动子的第-2位由T变为G获得的启动子变体，T7M6是指在T7启动子的第-4位由T变为G获得的启动子变体。2.权利要求1的方法所构建的表达岛，其中所述操纵子以BioBrick组件的形式组合。3.权利要求2的表达岛，其中的各个操纵子还带有彼此不同的限制酶位点。4.质粒，含权利要求2-3之一的表达岛。5.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王霞，杨建国，陈丽，杨云，王忆平，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：