间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种间日疟醛缩酶（aldolase）蛋白单克隆抗体的制备方法，该抗体是针对以aldolase蛋白为靶抗原，选择A、B、C三个优势抗原表位，通过柔性片段连接A、B、C三个优势抗原表位，形成重组子D，并在其上下游分别添加BamHI和XhoI限制性内切酶酶切位点，双酶切后插入载体PET-28a(+)载体中，构建重组蛋白D表达载体，利用大肠杆菌BL21表达重组蛋白D，免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到10株稳定分泌aldolase蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明专利技术所得单克隆抗体能特异性识别间日疟原虫aldolase蛋白，可用于间日疟感染的特异性检测，特异性高，反应灵敏，实验成本低，适合高通量快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和免疫学
，特别是ー种，所得单克隆抗体可应用于酶联免疫法检测间日疟原虫，也可作为间日疟原虫快速诊断试剂盒的一部分。
技术介绍
疟疾广泛流行于热带和亚热带发展中国家，是ー种由蚊媒传播的严重危害人类健康的寄生虫病。间日疟原虫对人类的危害仅次于恶性疟原虫,据估计全球收到间日疟原虫感染的人口高达26亿，毎年约有O. 8^3亿的人口因受到间日疟原虫感染而急性发作，在我国，2000年后疟疾疫情呈上升趋势，每年估计有70万左右疟疾患者，其主要是间日疟患者，尽管2007年后疫情得到遏制，但是其流行程度仍然处于上升趋势。 采用传统的厚血膜镜检费时费力，检测效率低下，近年来，核酸检测方法在疟疾诊断中得以应用，虽然该方法具有高度的特异性和敏感性，但是技术要求较高，需要技能熟练的操作员，阻碍了该方法的进ー步普及。因此，寻求灵敏特异，简便快速的疟疾诊断方法在当前疟疾防治工作中显得尤为重要。开发具有高灵敏度、高特异性的间日疟抗体是建立间日疟体外诊断技术的首要任务。间日疟原虫的宿主只有两个，人和按蚊。通过中间宿主按蚊传播疾病,被感染的人患疟疾。其生活史分为三个时期红细胞外期、红细胞内期和红细胞期，只有红细胞内期发生在红细胞内，其余两个发生在肝细胞中。疟疾特异性检测(RDTs)是ー种可以检测疟疾寄生虫特异性抗原的横向层析方法。RDTs方法提高了疟疾诊断和实例诊断的准确性，尤其是当镜检不可用或者不可靠的情况下。市场上已经有很多种RDT产品可以购买，其中一些是只可以检测恶性疟原虫，而其他的ー些可以检测恶性疟原虫同时检测出ー种甚至三种以上的人源疟疾。RDTs检测中主要是以HRP II和疟原虫乳酸脱氢酶为靶抗原来检测恶性疟原虫，然而疟原虫pan-specific乳酸脱氢酶和醛缩酶通常被当作检测另外三种疟原虫的靶抗原。醛缩酶是疟原虫糖酵解过程中的关键酶。与高等脊椎动物拥有三种醛缩酶(同エ酶)不同的是，间日疟原虫和恶性疟原虫拥有同一种醛缩酶，与锥体虫和贾第虫类似。间日疟原虫和恶性疟原虫的醛缩酶都含有390个氨基酸，他们的核苷酸和氨基酸序列的相对保守。因此，本申请选用醛缩酶作为靶抗原，分析其序列，选择其优势抗原表位，筛选反应灵敏度高，特异性强的单克隆抗体，以降低以HRP II和疟原虫乳酸脱氢酶为靶抗原可能出现的漏检风险。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供ー种间日疟原虫醛缩酶(aldolase)蛋白单克隆抗体的制备方法。由该方法所得的间日疟单克隆抗体反应灵敏度高，特异性强，成本低，可大規模制备作为商品化检测试剂盒的原料。，其特征在于，包括以下步骤(1)用柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC将间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位A、B、C相连接，得到重组子D ;其中， 抗原表位 A 的核酸序列为GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT ； 抗原表位 B 的核酸序列为ATTGGITTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC ；抗原表位 C 的核酸序列为AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGG GAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT ； 重组子 D 的核酸序列为GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCTGGCAGCGGCAGCGGCATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTAGGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACCGGCAGCGGCAGCGGCAACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAA GGGAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT ； (2)将重组子D和载体PET-28a( + )用BamHI和XhoI进行双酶切，将重组子D连接到载体PET-28a ( + )上，转化大肠杆菌BL21，筛选得到重组蛋白D表达菌株； (3)诱导表达重组蛋白D;重组蛋白D的氨基酸序列为GluGlyllelleProGlyIle LysValAspLysGlyLeuValThrlleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLySGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgpheAlaLysTrpArgAlaGlySerGlySerGlyIIeGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerlleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThrGlySerGlySerGlyAsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu ； (4)将获得的重组蛋白D超声破碎并低温离心，溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，洗脱得到纯化重组蛋白D ； (5)用纯化后重组蛋白D免疫Balb/c小鼠，多次免疫尾静脉采血测定血清效价后,取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，并用HAT筛选得到稳定的杂交瘤细胞株； (6)将杂交瘤细胞株注射到液体石蜡预处理的Fl小鼠腹腔，隔周取腹水，50%饱和硫酸铵沉淀法和Protein G亲和纯化单抗,得到单克隆抗体。进ー步地，间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位A的氨基酸序列为GluGlyIleIleProGlylleLysValAspLysGlyLeuValThrlleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAla。间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位B的氨基酸序列为JleGlyPheLeuThrVal ArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)用柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC将间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位A、B、C相连接，得到重组子D ;其中， 抗原表位 A 的核酸序列为GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT ； 抗原表位 B 的核酸序列为ATTGGITTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC ； 抗原表位 C 的核酸序列为AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGG GAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT ； 重组子 D 的核酸序列为GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCTGGCAGCGGCAGCGGCATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTAGGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACCGGCAGCGGCAGCGGCAACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGGGAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT ； (2)将重组子D和载体PET-28a( + )用BamHI和XhoI进行双酶切，将重组子D连接到载体PET-28a ( + )上，转化大肠杆菌BL21，筛选得到重组蛋白D表达菌株； (3)诱导表达重组蛋白D:重组蛋白D的氨基酸序列为GluGlyllelleProGlyIle LysValAspLysGlyLeuValThrlleProCysThrAspAspG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈东，张海燕，庞醒华，
申请(专利权)人：杭州傲锐生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：