杂交瘤细胞株及其分泌的抗利他林单克隆抗体和应用制造技术

本发明专利技术公开杂交瘤细胞株及其分泌的抗利他林单克隆抗体和应用。一种分泌抗利他林的杂交瘤细胞株3G12.7，保藏编号为CCTCC No.C202069；抗利他林单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株3G12.7或其传代细胞株分泌产生。该抗体为IgG1型,轻链为kappa型。上述抗利他林单克隆抗体用于制备利他林检测试剂盒中的应用或用于制备检测利他林的胶体金免疫诊断试纸条中的应用。本发明专利技术抗利他林单克隆抗体效价高，特异性强，可用于对利他林进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株及其分泌的抗利他林单克隆抗体和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗利他林单克隆抗体和应用。
技术介绍
利他林，即盐酸哌甲酯片，是一种中枢神经兴奋药物，主要用于治疗注意缺陷多动障碍(即儿童多动综合征)、发作性睡病，以及巴比妥类、水合氯醛等中枢抑制药过量引起的昏迷，也有人尝试用于小儿遗尿。对于儿童注意力缺陷及多动症，利他林可减轻多动症状，提高注意力，让孩子的精神集中，一定程度上提高学习能力。但是，长期服用利他林具有成瘾性，属于国家严格管制的一类精神药品，因此只能在医院凭医生的处方调配，并根据患者的病理生理情况和疗程限量供应。滥用利他林的危害很大。利他林能广泛兴奋大脑皮层，因此其不良反应多见，主要包括失眠(中枢兴奋作用引起)、头晕、头痛(可能是血压升高引起)、恶心、厌食、心跳加快等。此外，长期应用利他林可产生药物依赖。曾有研究报道，利他林可抑制儿童的生长发育，因此建议6岁以下儿童应避免使用。利他林中毒症状包括焦虑、紧张、精神错乱、谵妄、幻觉等精神症状，严重者可出现昏迷、惊厥甚至死亡。即使是在临床上，以治疗为目的使用利他林都特别谨慎。一般通过剂量滴定的方法确定用药剂量，医生通过观察患者对治疗的耐受情况，以及治疗效果来确定给药剂量和疗程。患者要在早餐或午餐前服用药物，傍晚后不宜服药，以免引起失眠。癫痫儿童应避免使用，以免诱发癫痫。服用单胺氧化酶抑制剂(如抗结核药物异烟肼)的患者应禁用利他林，以免引起严重高血压。利他林对于轻微脑功能紊乱的患儿有效，能促使患儿增强自我控制能力，集中注意力，减少小动作，增加学习兴趣，从而提高学习成绩。但是对于未患病的普通儿童，利他林提高其注意力的作用极其有限，而且还会发生毒副反应，因此通过服用利他林来提高学习成绩，几乎不可能。考试期间，学生精神压力大、神经紧张，如果此时服用利他林等中枢兴奋药物，可能导致考生兴奋过度，甚至发生狂躁。口服利他林后，约80％的剂量会在24小时内通过尿液排出体外，其中约60％转化为利他林酸。2008年国际反兴奋剂机构已将利他林列为特定刺激剂，禁止选手在比赛中使用。通过杂交瘤技术可以制备抗利他林杂交瘤细胞株。通过此杂交瘤细胞株纸制备出的抗体能用于制备胶体金免疫诊断试纸条，实现了在现场对人员快速检测的要求。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供了一种分泌抗利他林单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能产生高效价的抗利他林单克隆抗体。一种分泌抗利他林的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株3G12.7，已于2020年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCCNo.C202069；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。本专利技术采用小剂量肌肉注射免疫方法和尾静脉免疫相结合的方法，用利他林注射小鼠，获得免疫的小鼠脾细胞，进而将免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，用利他林进行筛选，从而获得所述杂交瘤细胞株。利他林本身的分子量太小，其不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，因此本专利技术对利他林进行化学修饰，偶联BGG(牛血清丙种球蛋白)获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的人工抗原(MPD-BGG)。所述的利他林分子结构式(I)所示：每次注射时，利他林的使用量为25μg。采用小剂量肌肉注射免疫方法和腹腔免疫相结合的方法免疫小鼠，免疫效价高。本专利技术还提供了所述杂交瘤细胞株在制备用于检测利他林的试纸条中的应用。本专利技术的第二个目的是提供一种抗利他林单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株3G12.7或其传代细胞株分泌产生。该抗体为IgG1型,轻链为kappa型。本专利技术的第三个目的是提供上述抗利他林单克隆抗体用于制备利他林检测试剂盒中的应用或用于制备检测利他林的胶体金免疫诊断试纸条中的应用。所述检测试剂盒为竞争抑制ELISA检测试剂盒；其内还含有利他林标准品和酶标二抗。由于利他林本身分子结构的限制，本专利技术的检测试剂盒是以竞争抑制ELISA原理制备的。使用时，先包被利他林标准品，再加入待测样品，然后依次加入所述抗抗利他林单克隆抗体、酶标二抗，进行反应，检测OD450值，计算竞争抑制率。利他林标准品的包被量以所述抗利他林单克隆抗体对利他林的检测阈值为宜。所述酶标二抗可选用羊抗鼠IgG-HRP。本专利技术所述检测试剂盒为竞争型酶联免疫试剂盒；其内含有包被有抗利他林单克隆抗体的酶标板、利他林标准品、酶标抗原、底物和终止液。使用时，待检测样品和酶标记的利他林抗原一起加入酶标板反应，若样品中残留有利他林，则会与酶标利他林抗原竞争结合板上的抗体，再加入底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的利他林量成反比。根据利他林标准品做出的标准曲线，计算出样品中的利他林的含量。本专利技术所述的用于检测利他林的胶体金免疫诊断试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫；所述标记物垫包被有胶体金标记的所述抗利他林单克隆抗体，所述反应膜的检测线(T线)处包被有利他林-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。本专利技术的试纸条也是以竞争抑制ELISA原理制备的，利他林-牛血清白蛋白复合物的包被量也是以所述抗利他林单克隆抗体对利他林的检测阈值为宜。检测时，若只有C线显色，表示待测样品中含有利他林且检测利他林的含量高于检测限；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测利他林的含量低于检测阈值，或待测样品中无利他林；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术利用MPD-BGG免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾细胞制备获得杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗利他林单克隆抗体效价高，特异性强，可用于对利他林进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。杂交瘤细胞株3G12.7，已于2020年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCCNo.C202069；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。说明书附图图1为本专利技术一种利他林胶体金检测试纸条的结构示意图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术做进一步详细说明。实施例1利他林人工抗原的制备(1)将10mg利他林、5mgN-羟基琥珀酰亚胺、15mg二环已基碳酰亚胺溶解于1mlN,N-甲基甲酰胺中，冰水浴中搅拌6h，记为A液。(2)将10mg牛血清丙种球蛋白(BGG)溶于0.01mol/LPBS溶液中，记为B液。(3)将A液缓慢滴加入搅拌中的B液中，然后室温搅拌反应2h。将混合溶液至于PBS溶液中透析4次，每次时长超过6h，即可得人工抗原MPD-B本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗利他林杂交瘤细胞株，其特征在于命名为杂交瘤细胞株3G12.7，保藏编号为CCTCC No.C202069。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗利他林杂交瘤细胞株，其特征在于命名为杂交瘤细胞株3G12.7，保藏编号为CCTCCNo.C202069。


2.一种抗利他林单克隆抗体，其特征在于由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。


3.如权利要求2所述的抗利他林单克隆抗体在制备利他林检测试剂盒中的应用。


4.如权利要求2所述的抗利他林单克隆抗体在制备检测利他林的胶体金免疫诊断试纸条中的应用。


5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的用于检测利他林的胶体金免疫诊断试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫；所述标...

【专利技术属性】
技术研发人员：应祺，俞思，吴银飞，
申请(专利权)人：杭州傲锐生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33