一种杂交瘤细胞对和其分泌的单克隆抗体对及其在检测G10-EPSPS蛋白中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种杂交瘤细胞对，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO.C202070，中国典型培养物保藏中心CCTCC；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO.C202071，中国典型培养物保藏中心CCTCC。本发明专利技术还提供了由这2株杂交瘤细胞分泌的一对配对的单克隆抗体和它们在检测G10‑EPSPS蛋白中的用途。本发明专利技术通过ELISA实验能够对植物中存在的G10‑EPSPS蛋白进行定性定量检测，具有特异性强、灵敏度高、简单快速等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种杂交瘤细胞对和其分泌的单克隆抗体对及其在检测G10-EPSPS蛋白中的应用
本专利技术涉及农业生物
，具体地，涉及一种杂交瘤细胞对和其分泌的单克隆抗体对及其在检测G10-EPSPS蛋白中的应用。
技术介绍
大豆是我国重要的蛋白和油料作物，在农业生产中具有不可或缺的地位。利用基因工程手段将与抗除草剂有关的基因转入大豆，育成高抗除草剂大豆品种，可节约大豆生产中人工除草的成本，降低草害，提高大豆的产量。草甘磷是一种非选择性的广谱除草剂，具有高效、低毒、无残留等优点，尤其是对人畜毒害小，是全球应用最广的除草剂之一。草甘膦主要通过抑制5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶，EPSPS)的活性而阻断芳香族氨基酸的合成，最终导致受试植物死亡。但是作为一种非选择性除草剂，草甘膦对农作物同样具有灭生性作用，这极大限制了草甘膦在农业生产中的应用范围。美国孟山都公司通过向植物中转入具草甘膦抗性的CP4-EPSPS基因，成功培育出了商业化的转基因抗草甘膦作物，为草甘膦的应用开辟了新途径。目前已经获得了大豆、玉米、棉花、油菜、烟草、甜菜、花生、小麦、水稻或向日葵等抗草甘膦转基因作物。近年来包括美国和中国在内的国家，草甘膦产量急剧增加还与系列转基因抗草甘膦品种的选育和大面积的推广有直接的关系。我国目前年产草甘膦约3万吨，实际生产能力超过4.5万吨，已成为继美国之后世界第二大生产和出口国。在转基因抗草甘膦作物方面的研究取得了一些成果，但目前尚无转抗草甘膦基因作物进入商品化阶段的报道，这与我国作为世界草甘膦生产和出口第二大国的地位是极不相称的。特别是入关以后，这种来自外部的冲击对我国植物抗草甘膦基因工程研究和草甘膦生产所造成的不利影响将越来越严重。EPSP合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase,EPSPS)是生物体内芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的关键性酶；草甘磷是通过抑制EPSP合成酶的活性而阻断芳香族氨基酸的合成最终导致受试植物死亡。但是某些细菌的EPSP合成酶的活性不被草甘膦所抑制，所以将细菌EPSPS基因的表达在植物体内，可以使植物免受除草剂的伤害。对转基因植物的检测是对转基因植物进行有效监管的基础。对转基因植物的鉴定检测方法主要有：(1)蛋白免疫印迹检测；(2)整合位点侧翼序列PCR检测；(3)外源基因特异引物PCR检测；(4)Southernblot分子杂交检测等，其中PCR方法对场地、仪器、技术人员的要求比较高，样本处理复杂，不适合大量的筛选检测。而利用免疫学原理对目的蛋白特异性进行定性定量鉴定的蛋白免疫印迹检测方法，是目前转基因植物最精准的鉴定方法之一。利用外源蛋白抗体可以通过westernblot和ELISA方法进行定性定量分析，检测转基因植物中目的蛋白在不同组织器官和不同环境条件下的表达水平。胶体金试纸法将特异的抗体交联到试纸条上，利用胶体金试纸条技术制备的单克隆抗体试纸条，可以对转基因幼苗或者种子进行快速的检测鉴定。而G10-EPSPS为一个新引进的转基因蛋白，相关抗体、杂交瘤细胞、检测方法的研究报道较少。
技术实现思路
为了对G10-EPSPS抗除草剂转基因蛋白的灵敏鉴定、对相关转基因植物进行有效监管和对转基因后代进行快速筛选检测，本专利技术提供一种杂交瘤细胞对和其分泌的单克隆抗体对及其在检测G10-EPSPS蛋白中的应用，主要目的在于提供对转G10-EPSPS基因植物中G10-EPSPS蛋白的快速灵敏的检测抗体和检测方法。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种杂交瘤细胞对，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCCNO.C202070，中国典型培养物保藏中心CCTCC；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCCNO.C202071，中国典型培养物保藏中心CCTCC。第二方面，本专利技术提供一种单克隆抗体对，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述的第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述的第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCCNO.C202070，中国典型培养物保藏中心CCTCC；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCCNO.C202071，中国典型培养物保藏中心CCTCC。专利技术人所在的研究组前期研究从假单胞杆菌(g10)中克隆到抗除草剂的EPSPS基因5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase(G10-EPSPS)，并通过原核表达获得重组蛋白，将重组蛋白免疫小鼠，并通过大量试验筛选得到特异性强的单克隆抗体，最终开发出定量检测G10-EPSPS蛋白含量的酶联免疫定量检测试剂盒。具体方案包括：将从G10中获得G10-EPSPS基因经过优化重组构建入大肠杆菌原核表达系统，通过表达纯化得到重组G10-EPSPS蛋白；用该蛋白诱导免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过筛选获得特异性单克隆抗体细胞株，通过制备腹水的方式，经过纯化获得特异性单克隆抗体；用HRP偶联抗体，用双抗体夹心的ELISA方法，筛选配对抗体；通过优化得到ELISA试剂盒体系，建立双抗体夹心的ELISA方法；生产试剂盒，对实际样本进行检测。第三方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的杂交瘤细胞对在检测G10-EPSPS蛋白中的应用。优选地，所述检测G10-EPSPS蛋白的样品来源包括棉花、玉米或大豆。优选地，所述G10-EPSPS蛋白的序列为SEQIDNO.1。SEQIDNO.1的序列如下:MAQVSRICNGVQNPSLISNLSKSSQRKSPLSVSLKTQQHPRAYPISSSWGLKKSGMTLIGSELRPLKVMSSVSTAEKGSDALPATFDVIVHPARELRGELRAQPSKNYTTRYLLAAALAEGETRVVGVATSEDAEAMLRCLRDWGAGVELVGDDAVIRGFGARPQAGVTLNPGNAAAVARLLMGVAALTSGTTFVTDYPDSLGKRPQGDLLEALERLGAWVSSNDGRLPISVSGPVRGGTVEVSAERSSQYASALMFLGPLLPDGLELRLTGDIKSHAPLRQTLDTLSDFGVRATASDDLRRISIPGGQKYRPGRVLVPGDYPGSAAILTAAALLPGEVRLSNLREHDLQGEKEAVNVLREMGADIVREGDTLTVRGGRPLHAVTRDGDSFTDAVQALTAAAAFAEGDTTWENVATLRLKECDRISDTRAELERLGLRARETADSLSVTGSAHLAGGITADGHGDHRMIMLLTLLGLRADAPLRITGAHHIRKSYPQFFAHLEALGARFEYAEATAYRS.第四方面，本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞对，其特征在于，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C202070，中国典型培养物保藏中心CCTCC；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C202071，中国典型培养物保藏中心CCTCC。/n

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞对，其特征在于，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCCNO:C202070，中国典型培养物保藏中心CCTCC；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCCNO:C202071，中国典型培养物保藏中心CCTCC。


2.一种单克隆抗体对，其特征在于，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述的第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述的第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCCNO:C202070，中国典型培养物保藏中心CCTCC；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCCNO:C202071，中国典型培养物保藏中心CCTCC。


3.权利要求1所述的杂交瘤细胞对在检测G10-EPSPS蛋白中的应用。


4.权利要求2所述的单克隆抗体对在检测G10-EPSPS蛋白中的应用。


5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述检测G10-EPSPS蛋白的样品来源包括棉花、玉米或大豆。


6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述G10-EPSPS蛋白的序列为SEQIDNO.1。

【专利技术属性】
技术研发人员：寿惠霞，赵杨，李林，吴蔚，徐伟，杨文杰，陶渊超，
申请(专利权)人：浙江大学，无锡福阳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33