一种非洲猪瘟病毒截短蛋白p54制备的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术是属于临床免疫学技术领域，公开了一种非洲猪瘟病毒截短蛋白p54制备的单克隆抗体及其应用。本发明专利技术通过免疫有效截短后的非洲猪瘟病毒蛋白p54，以及系统地筛选杂交瘤技术，最终获得了单抗克隆抗体4‑4C。所获单克隆抗体能够与非洲猪瘟全病毒反应，达到单克隆抗体基本要求；此外，该单克隆抗体的特异性好，与非洲猪瘟病毒其他蛋白之间无交叉反应；再者，该单克隆抗体通过Elisa检测后，其效价高达1600000；最后该单克隆抗体具有阻断效果，所建立的阻断Elisa检测方法，与OIE推荐使用的西班牙检测试剂盒检测效果相当，且缩短了检测时间，具有为猪场检测非洲猪瘟抗体水平的能力。

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒截短蛋白p54制备的单克隆抗体及其应用
本专利技术是属于临床免疫学
，涉及非洲猪瘟病毒的检测与鉴定
，具体涉及一种非洲猪瘟病毒截短蛋白p54制备的单克隆抗体，还涉及一种分泌非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，同时还涉及截短蛋白p54制备的单克隆抗体在制备检测非洲猪瘟病毒试剂盒中的应用。
技术介绍
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、高度接触性的动物传染病，具有发病率高，病程短，死亡率高等特点。非洲猪瘟病毒属于非洲猪瘟病毒科，双链DNA病毒，其基因组大，170-190bp，且基因多变，基因组两端各有一个多变区，基因型多达24个，编码150-200个蛋白。自2018年我国出现非洲猪瘟以来，给我国养猪行业带来巨大经济损失，同时也影响生猪产业相关的国际贸易。虽然目前非洲猪瘟疫情已经慢慢得到控制，但是并没有有效疫苗能预防非洲猪瘟的爆发，因此非洲猪瘟的防控以及检测至关重要。目前主要的血清学检测方法为酶联免疫吸附试验(Elisa)。Elisa检测法主要有应用于抗体水平检测，具有操作简便，特异性好，灵敏度高等特点。并且该方法适合于大批量样品的检测，OIE亦将Elisa法作为诊断非洲猪瘟病毒的首选血清学方法。国内并没有国家批准的ASFV抗体检测试剂盒，OIE推荐使用的是西班牙英吉纳(Ingezim)试剂盒，该试剂盒的包被抗原是非洲猪瘟病毒蛋白p72，利用针对p72蛋白的单克隆抗体建立的阻断Elisa检测方法。Elisa法检测抗体主要为间接Elisa方法和阻断Elisa方法。二者都是将抗原吸附于固相载体，检测抗体。不同的是，间接Elisa法的酶标抗体是二抗，与待检抗体结合，底物降解的量与抗体量相等；阻断Elisa方法的酶标抗体是一抗，与抗原结合，与待测血清抗体具有相同的靶标。阻断ELISA方法由于采用的是蛋白纯度很高的单抗，大大提高了检测的特异性，减少了间接ELISA方法的交叉反应和非特异性反应。由于国外检测试剂盒价格昂贵且耗时长，因此，本专利技术通过杂交瘤技术获得单克隆抗体，尝试建立阻断Elisa方法，能够替代国外试剂盒，达到能够检测非洲猪瘟病毒抗体水平的效果。然而在制备单克隆抗体的过程，有诸多问题。首先，免疫原的选择至关重要，免疫原直接影响后续杂交瘤细胞的筛选，继而影响所获得的单克隆抗体的质量。本专利技术使用的免疫原是通过有效截短后的非洲猪瘟病毒蛋白p54，该免疫原通过westernblot检测后发现其具有免疫学活性，且它表达在上清，是可溶性的优质免疫原。其次，免疫了优质抗原后，在细胞融合以及阳性克隆细胞筛选过程中均有阻碍，例如，尽管细胞融合的成功率高，但所融合成功的细胞并不具备分泌单一抗体的能力；在细胞筛选过程中，部分杂交瘤细胞状态不稳定，在多次亚克隆后，染色体丢失，不能继续分泌单一抗体；在获得分泌单一抗体的杂交瘤细胞后，通过免疫小鼠，获取腹水，所得腹水效价不高；而有的单抗制备后，由于识别的靶点与待测血清不一致，无法建立阻断Elisa检测方法。根据以上问题，本专利技术通过免疫有效截短后的非洲猪瘟病毒蛋白p54，以及系统地筛选杂交瘤技术，最终获得了单抗克隆抗体4-4C。所获单克隆抗体能够与非洲猪瘟全病毒反应，达到单克隆抗体基本要求；此外，该单克隆抗体的特异性好，与非洲猪瘟病毒其他蛋白之间无交叉反应；再者，该单克隆抗体通过Elisa检测后，其效价高达1600000；最后该单克隆抗体具有阻断效果，所建立的阻断Elisa检测方法，与OIE推荐使用的西班牙检测试剂盒检测效果相当，且缩短了检测时间，具有为猪场检测非洲猪瘟抗体水平的能力。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗非洲猪瘟病毒p54单克隆抗体，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞4-4C分泌得到，该抗体对非洲猪瘟病毒抗体有阻断效果，该杂交瘤细胞已于2020年7月16日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCCNO：C2020122，分类命名：杂交瘤细胞株4-4C，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的另一个目的在于提供了抗非洲猪瘟病毒p54单克隆抗体的应用，利用本专利技术的抗体可制备检测非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体试剂盒，为非洲猪瘟的临床抗体检测提供方法。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株4-4C的获得是利用原核表达非洲猪瘟病毒截短p54蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术建立抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞库获得的。该杂交瘤细胞已于2020年7月16日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCCNO：C2020122，分类命名：杂交瘤细胞株4-4C，地址：中国武汉武汉大学。所获得的杂交瘤细胞株4-4C在37℃，5％CO2的培养箱中以半贴壁的方式生长，用显微镜观察细胞，所呈现的状态为：细胞生长良好，浑圆透亮，呈葡萄串状，并且能稳定的分泌针对p54的单克隆抗体。对杂交瘤细胞4-4C最高限制代次(F25代)的细胞进行传代稳定性检测，结果每代细胞均能稳定分泌特异性的单克隆抗体，抗体阳性率为100％，说明该杂交瘤细胞具有稳定分泌抗体的能力。一种抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体的应用，所述的单抗可用于建立非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法，鉴定待测动物样本是否感染非洲猪瘟病毒或者待检血清中是否含有非洲猪瘟病毒抗体。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术所用的免疫原为截短非洲猪瘟重组蛋白p54(SEQIDNO.1所示)，该免疫原具有良好的免疫原性，同时，可以建立间接ELISA方法检测非洲猪瘟病毒抗体。2.本专利技术从得到的7株分泌抗ASFV单克隆抗体的杂交瘤细胞进行三次亚克隆，最终筛选出一株稳定分泌抗体且生物特性好的杂交瘤细胞，用其制备的腹水纯化后进行Elisa检测，结果显示Elisa效价高达1.6×106。3.本专利技术得到的4-4C单抗，通过Elisa检测以及westernblot方法验证后发现，所获单抗具有与非洲猪瘟病毒反应的能力。4.本专利技术得到的4-4C单抗，可用于制备非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒可检测血清样本中的非洲猪瘟抗体，为养猪行业对非洲猪瘟病毒抗体的检测提供检测方法。用该方法检测了大量猪血清，并用公式(1-样品OD值/阴性对照OD值)来计算血清阻断率，最终确定：猪血清的阻断率大于或等于0.5判为阳性，小于0.5判为阴性。本方法与OIE推荐使用的西班牙检测试剂盒有99％以上的符合率，但相比而言，本专利技术建立的方法检测时间为70分钟，而西班牙检测试剂盒检测时间为105分钟，相比而言，缩短了试验时间，操作步骤更简单。附图说明图1为单抗4-4C纯化后SDS-PAGE图图2为单抗4-4C与ASFV反应westernblot图具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：制备抗非洲猪瘟病毒p54单克隆抗体以及获得分泌的杂交本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的杂交瘤细胞，其保藏编号为：CCTCC NO：C2020122。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的杂交瘤细胞，其保藏编号为：CCTCCNO：C2020122。


2.权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，杨永，张强，赵亚，孙小美，吕长杰，杨丽，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42