本发明专利技术公开一种猫A型血天然抗原的提取纯化及其多抗和应用，对猫A型血进行离心和破碎提纯后，获得猫A型血红细胞上突出在细胞表面的A抗原，高度提纯后获得本发明专利技术所述猫A型血天然抗原，即CAB天然抗原，免疫抗原特异性好，能刺激动物产生大量抗CAB多克隆抗体。本发明专利技术提供的抗CAB多克隆抗体，通过采集免疫CAB天然抗原的动物血清，再通过亲和层析法获得。抗CAB多克隆抗体通过CAB亲和柱的纯化，在不大幅降低抗体效价灵敏度的情况下，进一步提升灵敏度，提高纯度。提高纯度。提高纯度。
【技术实现步骤摘要】
一种猫A型血天然抗原的提取纯化及其多抗和应用
[0001]本专利技术涉及生物
，具体设计一种猫A型血天然抗原的提取纯化及其多抗和应用。
技术介绍
[0002]研究发现，猫的血型只有A型、B型、AB型三种，没有O型血。虽然都有A，B，AB型，但是猫的血型的遗传法和人类完全不同。在猫的血型基因中，A型血是显性基因，只需要一组染色体即可显现A型血特征。而B型血是隐性的，一只幼猫必须从父母那里都继承B型血基因才可能获得B型血。而AB型血是独立遗传的，对于B型血来说是显性的，而对于A型是隐性的。
[0003]猫在紧急情况下失血过多需要输血。一般情况下，输血必须用同型的血液。因为猫中AB型非常稀少，可以用A型血代替。但是由于B型血中含有非常强的A型抗体，所以不能用B型血代替。猫没有血液库，一旦需要输血就需要健康猫上现采，因此，提前知道猫的血型对于猫失血过多的紧急救治极为重要。
[0004]目前在国内，猫血型的鉴别卡价格较贵，因此猫的血型鉴别并不普及。特别的，B型血猫由于数量少，一旦需要输血，短时间内很难找到匹配的供血猫。因此，急需一种便捷、快速、准确的方法对猫的血型进行检测。
技术实现思路
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种猫A型血天然抗原(CAB天然抗原)的提取纯化方法，目前市面上无法购买到用于猫血型鉴别的人工合成抗原，因此只能通过红细胞上提取A抗原，定义为CAB天然抗原。CAB天然抗原分子量较大，能够诱导动物机体产生特异性抗体。
[0006]一种猫A型血天然抗原(CAB天然抗原)的提取纯化方法，采用如下技术方案：
[0007]步骤(1)、将猫A型血用PBS溶液稀释，低温离心，弃上清得到沉淀；
[0008]作为优选，步骤(1)离心的转速为3000转/min；离心时间为10分钟；
[0009]作为优选，步骤(1)离心温度为4℃；
[0010]作为优选，步骤(1)猫A型血与PBS溶液的体积比为10：1。
[0011]步骤(2)、将沉淀溶于生理盐水，吹打均匀，低温离心，弃上清取沉淀；重复上述步骤多次；
[0012]作为优选，步骤(2)离心的转速为3000转/min；离心时间为15分钟；
[0013]作为优选，步骤(2)离心温度为4℃；
[0014]作为优选，步骤(2)重复次数为3次。
[0015]步骤(3)、将步骤(2)所得沉淀加入氯化铵中吹打均匀，低温离心，弃上清取沉淀，重复上述步骤多次；
[0016]作为优选，步骤(3)离心的转速为13000～15000转/min；离心时间为15分钟；
[0017]作为优选，步骤(3)离心温度为4℃；
[0018]作为优选，步骤(3)重复次数为3次。
[0019]步骤(4)、将步骤(3)所得沉淀溶于生理盐水，吹打均匀，低温离心，弃上清取沉淀，重复上述步骤直至沉淀变成乳白色，即得CAB天然抗原；
[0020]作为优选，步骤(4)离心的转速为10000转/min；离心时间为15分钟；
[0021]作为优选，步骤(4)离心温度为4℃。
[0022]步骤(5)、用0.01mol/L PBS溶液溶解CAB天然抗原，然后加入平衡完成的磁珠，孵育一段时间后洗涤，最后洗脱磁珠上的抗原，即进一步纯化的CAB天然抗原；所述磁珠上通过表层琼脂糖的游离端结合了猫A型血单克隆抗体。
[0023]作为优选，步骤(5)磁珠的孵育时间为60min。
[0024]作为优选，步骤(5)磁珠的洗涤时间为10min，磁珠洗脱时间为15min。
[0025]本专利技术的第二个目的是提供一种抗CAB多克隆抗体，由CAB天然抗原在免疫过程中产生，效价高、特异性强。
[0026]本专利技术的第三个目的是提供上述抗CAB多克隆抗体的制备方法，其如下：
[0027]步骤(1)、将CAB天然抗原稀释，与佐剂混合后对动物进行多次免疫，直至动物血清的效价满足进一步纯化的要求；将血清用硫酸铵纯化后获得抗体半成品；
[0028]步骤(2)、制备偶联高纯度CAB天然抗原的亲和柱；
[0029]具体是将100mL GE
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Sepharose
‑
4B填充胶用溴化氢活化，再将CAB天然抗原蛋白溶于0.01M碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)，立刻加入到活化好的填充胶中，搅拌均匀后过夜；然后用乙醇胺封闭，0.01M PBS冲洗平衡。
[0030]步骤(3)、将获得的抗体半成品过CAB天然抗原的亲和柱，收集流穿液，中间用ELISA测定效价；
[0031]步骤(4)、流穿液浓缩后透析多次，收集测定浓度体积，得到抗CAB多克隆抗体，
‑
20℃保存。
[0032]本专利技术采用高度提纯后的CAB天然抗原制成亲和柱，可在不大影响抗CAB多克隆抗体效价和灵敏度的同时进一步提升其特异性及纯度，使其能更好的应用于猫血型检测试剂盒中。
[0033]本专利技术的第四个目的是提供上述抗CAB多克隆抗体在制备猫血型检测试剂盒中的应用。
[0034]进一步的，所述的猫血型检测试剂盒，包括样品垫，反应膜和吸样垫；反应膜分为A，B，C三个区域，所述反应膜的A区域包被有抗CAB多克隆抗体，B区域包被有识别B血型的抗体，C区域包被有识别AB血型的抗体。
[0035]本专利技术的试纸条是以抗原抗体高度亲和原理制备的，抗CAB多克隆抗体的包被量也是以所述抗CAB多克隆抗体对猫A型血有效凝集的检测限为宜。检测时，若A区域和C区域血液凝集，则测试的猫血型为A型；若B区域和C区域血液凝集，则测试的猫血型为B型；若A区域，B区域和C区域血液凝集，则测试的猫血型为AB型。
[0036]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0037]1.本专利技术在提取纯化CAB天然抗原时采用了结合有猫A型血单克隆抗体的磁珠，经该磁珠纯化后得到的抗原纯度较高，特异性好，能刺激动物产生大量抗CAB多克隆抗体，而非其他不需要的抗体，为后续纯化提供便利；
[0038]2.免疫获得的抗CAB抗体，通过自制CAB亲和柱的纯化，能有效剔除抗体中剩余的
小部分猫全血抗体，进一步提升灵敏度(检测限可达500ng/mL)，提高纯度。
附图说明
[0039]图1为猫血型检测试剂盒的使用示意图。
具体实施方式
[0040]下面结合具体实施方式对本专利技术做进一步详细说明。
[0041]实施例1：CAB天然抗原的制备
[0042]1.溶液准备
[0043](1)猫A型血：100mL，采购自Bio
‑
Channel
[0044](2)稀释缓冲液：浓度为0.01M、pH值为7.4的PBS，生理盐水
[0045](3)细胞破碎液：浓度为0.125M的氯化铵
[0046]2.实验过程
[0047](1)将外购的100mL猫A型血，用0.01M PBS溶液稀释至8本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种猫A型血天然抗原的提取纯化方法，其特征在于，所述提取纯化方法包括如下步骤：步骤(1)、将猫A型血用PBS溶液稀释，低温离心，弃上清得到沉淀；步骤(2)、将沉淀溶于生理盐水，吹打均匀，低温离心，弃上清取沉淀；重复上述步骤多次；步骤(3)、将步骤(2)所得沉淀加入氯化铵中吹打均匀，低温离心，弃上清取沉淀，重复上述步骤多次；步骤(4)、将步骤(3)所得沉淀溶于生理盐水，吹打均匀，低温离心，弃上清取沉淀，重复上述步骤直至沉淀变成乳白色，即得猫A型血天然抗原；步骤(5)、用0.01mol/LPBS溶液溶解猫A型血天然抗原，然后加入平衡完成的磁珠，孵育后进行洗涤，最后洗脱磁珠上的抗原，即得纯化后的猫A型血天然抗原；所述磁珠上通过表层琼脂糖的游离端结合了猫A型血单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)中离心的转速为3000转/min；离心时间为10分钟；离心温度为4℃。3.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)中猫A型血与PBS溶液的体积比为10：1。4.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中离心的转速为3000转/min；离心时间为15分钟；离心温度为4℃。5.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)的重复次数均为3...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢清，
申请(专利权)人：杭州傲锐生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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