本发明专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE‑CdtB、其编码基因及其表达和应用，包括一种伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE‑CdtB基因、由该基因编码的重组融合蛋白、一种表达该重组融合蛋白的方法及其在制备胶体金检测试剂条中应用。本发明专利技术在大肠杆菌表达系统中重组表达了伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE‑CdtB，具有生产周期短，产量高，成本低，特异性好的优点；重组蛋白上的His标签有利于一步纯化达到较高的纯度，并且不需酶切即可表现较好地活性；以重组抗原可作为犬细小病毒胶体金检测试剂条的一部分，敏感性高，特异性好，稳定性好，操作简便，适合作为常规检测手段。
【技术实现步骤摘要】
一种伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB、其编码基因及其表达和应用
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB、其编码基因及其表达和应用。
技术介绍
沙门菌属是一种常见的能引起人畜共患病的革兰阴性菌，属于肠杆菌科。最早在1885年由TheobaldSmith和DanielElmerSalmon从猪霍乱分离出而得名。沙门菌属抗原复杂，以O抗原（壁抗原）和H抗原（鞭毛抗原）为基础的血清型分型达3000多种。这些血清型中的大部分能在人和动物间交叉感染，可引起从轻度腹泻到严重的脓毒症等一系列不同严重程度的疾病。沙门氏菌属主要包括两个种，肠道沙门氏菌和本哥利沙门氏菌。可分为7个亚型：I，II，IIIa，IIIb，IV，VI以及V，前6型属于S.enterica，而S.bongori属于亚型V。它们有95%～99%DNA序列是相似的。其中亚型I（肠道沙门氏菌）的宿主主要是哺乳动物和鸟类，这其中就包含一些重要的医学病原菌。依据沙门氏菌引起的人类临床综合症，又可将其简单的定义为两类：伤寒沙门氏菌和非伤寒沙门氏菌。沙门氏菌的致病性与其毒力因子有很大的关系。通过全基因组测序已经确定了许多与致病性相关的基因，这其中主要涉及众多的毒力因子，包括粘附因子，铁载体，荚膜，内毒素（LPS），外毒素，侵袭素和Ⅲ型和Ⅳ型分泌系统。沙门氏菌的致病性主要是受这些毒力基因控制的。这些可以引起宿主免疫炎症反应的毒力因子绝大多数是通过动物模型被确定和检测出来的。这些可以引起感染的毒力因子主要分为两类，一类是可以刺激固有免疫系统的病原相关因子，另一类是利用宿主炎症过程引起病理改变的毒性相关因子。还有一类毒力因子就是毒素基因，比如cdt基因，它编码的细胞膨胀毒素能使真核细胞缓慢膨胀死亡。在沙门氏菌属中cdtB最先发现于伤寒沙门氏菌和副伤寒A沙门氏菌中，与pltA、pltB一起发挥作用，引起细胞的凋亡和坏死，它们可能与伤寒沙门氏菌的感染有关。人畜感染沙门氏菌后可能加重病症或加大死亡率，也可能会降低动物繁殖力，造成巨大的经济损失，并严重威胁人民群众的身体健康和畜牧业的健康发展，对其防治历来是公共卫生的一项重要课题。快速、准确、简便地检测出沙门氏菌，在医疗卫生、食品卫生、动物疫病监测等方面具有重要的意义。检测沙门氏菌一直以传统检测方法为主，非选择性和选择性增菌、可疑细菌分离等常规方法虽然经典可靠，但程序复杂、十分繁琐，不仅费时费力而且敏感性和特异性较差，漏检率较高。目前也有一些如免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)技术等方法，如公开号为CN106290918A的“一种检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒”，包括：包被有重组蛋白PagC的固相载体、酶标抗体、沙门氏菌阴性血清和阳性血清。该专利技术的检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒及方法，对沙门氏菌属内广泛适用，应用范围广，该试剂盒具有较高的特异性和重复性，但是需要使用指定的仪器设备、具备相应的试验条件和技能，难以在基层推广，并且检测时间长，需要数小时才能检测出结果，标记稳定性也较差，不适合用于常规检测手段。
技术实现思路
本专利技术是为了克服现有检测方法对设备要求高、检测时间长、不适合用于常规检测的缺点，提供一种伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB、其编码基因及其表达和应用，能够将该蛋白用于胶体金检测试剂条的制备，标记技术敏感性高，特异性好，稳定性好，操作简便，适合作为伤寒沙门氏菌的常规检测手段。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB基因，其序列如SEQIDNO.2所示。由上述基因编码的一种伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB，其特征是，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB基因是根据NCBIGenebankNC_003277.2的蛋白序列设计的，通过分析其上的抗原表位，选取了其中最优势的抗原表位进行融合。包含上述重组抗原基因的重组载体。作为优选，所述载体为大肠杆菌BL21表达载体。本专利技术重组蛋白基因由人工合成，所用的载体为pET30a，为卡那抗性，融合表达组氨酸标签，蛋白定位于细胞周质。包含上述抗原基因的重组菌株。一种表达伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB的方法，包括以下步骤（1）将上述的重组载体转化大肠杆菌BL21细胞，得重组菌株；（2）重组菌株在35-37℃、LB培养基中摇瓶培养至OD=0.5-0.7，加入0.8-1.2mMIPTG，在35-37℃、200-250rpm下诱导表达3-5小时；（3）诱导结束后离心回收、破菌取上清并纯化所表达的伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB。本专利技术的表达系统为大肠杆菌BL21表达系统，它具有周期短，费用低，表达量大等特点；为了使得重组蛋白更好的保持活性位点，本专利技术选择比较温和的培养和诱导条件，其表达时的诱导温度在35-37℃，诱导转速为200-250rpm，诱导的IPTG浓度为0.8-1.2mM，这样使得重组蛋白有了更加缓慢的表达，有充分的时间进行空间构象的形成。作为优选，所述破菌使用超声破碎的方式进行，条件为350-450w，超声2-4s，间隔4-8s，共150-200次；纯化方式为亲和层析，缓冲体系为pH=7.8-8.2的40-60mMTris、0.15-0.25MNaCl，洗脱液中另加0.0.4-0.6MImidazole；纯化结束后以与纯化时相同的缓冲体系透析3-5次并无菌过滤，用BCA法测定浓度。重组蛋白中本专利技术加入了His标签，一步纯化能够达到较高的纯度，并且在得到较高纯度的重组蛋白后不需要酶切也能表现出较好的活性，相比于使用酶切才能产生活性的重组蛋白来说，减少了步骤，降低了成本。上述蛋白重组融合蛋白HlyE-CdtB在制备胶体金检测试剂条中应用。作为优选，所述胶体金检测试剂条的制备步骤如下：（1）在沸腾的纯水中加入氯金酸与柠檬酸三钠，继续加热沸腾10-20min后冷却至室温得到胶体金溶液；（2）在冷却后的胶体金溶液中加入K2CO3调节至pH=6.8-7.2，加入伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB，搅拌20-40min后加入BSA溶液，再次搅拌20-40min后离心取沉淀，将沉淀用金标稀释液稀释后浸泡玻璃纤维，冻干后得到金标垫；（3）用点膜稀释液稀释proteinA至0.8-1.2mg/mL，用相同稀释液稀释羊抗OspC-VlsE多抗至0.4-0.6mg/mL，将上述两种稀释之后的溶液划线至硝酸纤维素膜上，35-37℃烘干过夜，其中点膜稀释液为pH7.2-7.5的10-20mMPBS、0.8-1.2wt%蔗糖溶液；（4）将以上金标垫、包被好的硝酸纤维素膜及滤纸、聚酯板、样品垫等组装成胶体金检测试剂条。本专利技术制备得到的胶体金检测试剂条为间接法胶体金检测试剂条，相比于其他检测方式来说，具有方便快捷、特异敏感、稳本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB基因，其特征是，所述的重组抗原基因序列如SEQ ID NO.2 所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB基因，其特征是，所述的重组抗原基因序列如SEQIDNO.2所示。
2.由权利要求1所述基因编码的一种伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB，其特征是，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.包含权利要求1所述的重组融合蛋白HlyE-CdtB基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征是，所述载体为大肠杆菌BL21表达载体。
5.包含权利要求1所述抗原基因的重组菌株。
6.一种表达伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）将权利要求4所述的重组载体转化大肠杆菌BL21细胞，得重组菌株；
（2）重组菌株在35-37℃、LB培养基中摇瓶培养至OD=0.5-0.7，加入0.8-1.2mMIPTG，在35-37℃、200-250rpm下诱导表达3-5小时；
（3）诱导结束后离心回收、破菌取上清并纯化所表达的伤寒沙门氏菌重组融合蛋白HlyE-CdtB。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述破菌使用超声破碎的方式进行，条件为350-450w，超声2-4s，间隔4-8s，共150-200次；纯化方式为亲和层析，缓冲体系为pH=7.8-8.2的40-60mMTris、0.15-0.25MNaCl，洗脱液中另加0.4-0.6MImidazole；纯化结束后以与纯化时相同的缓冲体系透析3-5次并无菌过滤，...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓杰，阮美丽，吴银飞，
申请(专利权)人：杭州傲锐生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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