细胞抗逆基因片段及改造的HepG2细胞制造技术

本发明专利技术公开了一种细胞抗逆基因片段及改造的HepG2细胞，其中细胞抗逆基因片段，由CPS1、OATP1B3两种基因片段顺序构成。以该基因片段改造的HepG2细胞，促细胞生长因子ALR分泌增加5％，肝细胞生长因子HGF分泌增加一倍，反应到促肝损伤后恢复速度提高10倍，细胞抗逆能力大大提升。

【技术实现步骤摘要】
细胞抗逆基因片段及改造的HepG2细胞
本专利技术涉及基因工程领域，具体地指一种细胞抗逆基因片段及改造的HepG2细胞。
技术介绍
HepG2细胞是一种肝癌细胞。该细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。现有HepG2细胞用做血液净化时，在高浓度的毒素血浆的环境下中容易出细胞核扩散，细胞会出现脱水凋亡的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有HepG2细胞的缺陷，提供一种细胞抗逆基因片段及改造的HepG2细胞。为实现上述目的，本专利技术首先提供了一种细胞抗逆基因片段，由CPS1、OATP1B3两种基因片段顺序构成，其中，各基因所对应分泌的蛋白如下：CPS1为氨甲酰磷酸合成酶1；OATP1B3为有机阴离子转运多肽1B3；所述细胞抗逆基因片段用于HepG2细胞基因改造。优选地，所述CPS1-OATP1B3的序列如SEQNo.1所示。本专利技术还提供了一种细胞抗逆基因表达质粒，包含权利要求1所述细胞抗逆基因片段。优选地，所述质粒还包括氨基糖苷类抗生素筛选压力基因片段，所述氨基糖苷类抗生素筛选压力基因片段连接于所述细胞抗逆基因片段的3’端。进一步优选地，所述质粒还包括启动子片段pTBSCH3，位于述细胞抗逆基因片段的5’端。更进一步优选地，所述质粒的序列如SEQNo.2所示。本专利技术还提供了一种包含细胞抗逆基因的HepG2细胞，包含上述功能片段，或利用上述的质粒改造HepG2细胞后获得。本专利技术中改造HepG2细胞采用的质粒包含的功能基因为：pTBSCH3-CPS1-OATP1B3-G418,如SEQNo.2所示，由多基因顺序连而成，CPS1细胞增殖有关并且是尿素循环及其关键酶，OATP1B3为跨膜转运蛋白家族的重要成员之一；G418为氨基糖苷类抗生素筛选压力。通过基因工程改造获得了HepG2-c细胞，相对于一代HepG2细胞，促细胞生长因子ALR分泌增加5％，肝细胞生长因子HGF分泌增加一倍，反应到促肝损伤后恢复速度提高10倍，细胞抗逆能力大大提升。从现有研究文献我们可以看到，没有证据显示针对CPS1和OATP1B3的改造直接能获得本专利技术的结果。参考文献如下：UnderstandingCarbamoyl-phosphateSynthetaseI(CPS1)DeficiencybyUsingExpressionStudiesandStructure-BasedAnalysis[HUMANMUTATION,Vol.31,No.7,801–808,2010]TargetingCPS1inthetreatmentofCarbamoylphosphatesynthetase1(CPS1)deficiency,aureacycledisorder[ExpertOpinTherTargets.2017Apr,21(4):391-399.]ClinicalImportanceofOATP1B1andOATP1B3inDrug-DrugInteractions[DrugMetab.Pharmacokinet.26(3):220227(2011).]CompleteOATP1B1andOATP1B3deficiencycauseshumanRotorsyndromebyinterruptingconjugatedbilirubinreuptakeintotheliver[TheJournalofClinicalInvestigationhttp://www.jci.orgVolume122Number2February2012]InteractionofSulfonylureaswithLiverUptakeTransportersOATP1B1andOATP1B3[BasicClinPharmacolToxicol.2018Aug,123(2):147-154.]本专利技术的有益效果：所改造获得的HepG2-c细胞，细胞抗逆能力大大提升，相比HepG2细胞针对毒素耐受的最大值提升100倍，HepG2-c细胞能适应更复杂的培养环境。附图说明图1为本专利技术用于HepG2细胞改造的质粒结构图。图2为HepG2和HepG2-c细胞与超高毒素血浆共培养12h后的细胞状态比较图。图3为HepG2和HepG2-c细胞多个细胞因子表达量比较图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步的详细描述。以下实施例中采用的试剂或产品，未标明出处的均为市售，不用于限制本专利技术。本专利技术中核心的功能基因片段由CPS1-OATP1B3两个基因构成，各个基因为人源，公开序列可以在(NCBIGenBank)中查询到。本专利技术中合成质粒中的该基因片段序列如SEQNo.1所示。实施例：HepG2细胞系改造的方案：1)全基因组合成pTBSCH3-CPS1-OATP1B3-G418，并进行线性化处理，序列如SEQNo.2所示。2)当天晚上消化好HepG2(美国模式菌种收集中心ATCC)，其序列在(NCBIGenBank)中可查，细胞，以40％-50％的密度种到T25中，过夜贴壁后，第二天上午进行转染。3)转染试剂及材料(质粒：转座子＝10:1)混匀，静置5min,加入T25中，根据细胞状态进行换液。4)细胞转染五天后，消化，并计数，每孔1000～2000个左右的细胞种96孔板。5)待细胞长够一定数量后，继续种板筛选。经前期摸索阴性细胞(HepG2)后，以5μg/ml的筛选浓度进行筛选，得到改造后的HepG2-c细胞。临床验证：对改造后的HepG2-c-4-12(第二代细胞，第4批次，传的第12代)，细胞密度75％，直接用于实验。细胞与超高毒素血浆共培养实验HepG2细胞与超高毒素血浆共培养12h后，90％的细胞出现脱水变形、细胞核扩散的现象；细胞存活率不到10％，如图2左。HepG2-c细胞与超高毒素血浆共培养24h后，存活率仍有95％以上，细胞抗逆能力增强，如图2右。细胞基因组分析：第三方对HepG2-c-4-12细胞基因测序，结果和HepG2细胞比较显示两者不同：HepG2细胞存在插入缺失变异和单核苷酸多态性(SNP)。外显子区的缺失插入变异有216个，SNP有16936个。对于氨代谢和胆红素代谢途径的酶，有一些SNP变异，基因组测序结果总结如表1：表1HepG2基因组分析HepG2-c细胞的蛋白组测序的分析：iTRAQ蛋白质组学的分析：HepG2-c细胞相比HepG2细胞，有226个蛋白表达发生上调，相对于正常肝细胞仍有88个蛋白发生下调。如图3所示，相对于未改造的HepG2细胞，HepG2-c细胞中促细胞生长因子ALR分泌增加5％，肝细胞生长因子HGF分泌增加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞抗逆基因片段，由CPS1、OATP1B3两种基因片段顺序构成，其中，各基因所对应分泌的蛋白如下：/nCPS1为氨甲酰磷酸合成酶1；/nOATP1B3为有机阴离子转运多肽1B3；/n所述细胞抗逆基因片段用于HepG2细胞基因改造。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞抗逆基因片段，由CPS1、OATP1B3两种基因片段顺序构成，其中，各基因所对应分泌的蛋白如下：
CPS1为氨甲酰磷酸合成酶1；
OATP1B3为有机阴离子转运多肽1B3；
所述细胞抗逆基因片段用于HepG2细胞基因改造。


2.一种细胞抗逆基因片段，其特征在于：所述CPS1-OATP1B3的序列如SEQNo.1所示。


3.一种细胞抗逆基因表达质粒，包含权利要求1所述细胞抗逆基因片段。


4.根据权利要求3所述的细胞抗逆基因表达质粒，其特征在于：还包括氨基糖苷类抗生素筛选压...

【专利技术属性】
技术研发人员：望威，王柯，丰明乾，
申请(专利权)人：武汉仝干医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42