融合蛋白、以及使用该融合蛋白的高密度脂蛋白的测定试剂盒制造技术

提供用于测定变性HDL的量及质的不含脂质的长期保存性良好的标准品的融合蛋白，以及使用该融合蛋白的精确地、重现性·可靠性良好地测定高密度脂蛋白的方法。融合蛋白中，在与凝集素样氧化LDL受体：LOX‑1结合的LOX‑1结合蛋白序列上，直接或隔着间隔子连接有载脂蛋白A1：ApoA I的全蛋白序列或部分片段蛋白序列。标本试样中的变性高密度脂蛋白的测定方法为基于变性高密度脂蛋白针对LOX‑1和抗ApoA I抗体的结合的变性高密度脂蛋白的测定方法，其中，将该融合蛋白作为变性高密度脂蛋白的标准品使用，并且通过光学检测和/或放射剂量检测，通过与前述标准品的比较求出标本试样中的变性高密度脂蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】融合蛋白、以及使用该融合蛋白的高密度脂蛋白的测定试剂盒
本专利技术涉及用作变性高密度脂蛋白的测定的标准品的融合蛋白、用于形成该融合蛋白的核酸及载体及细胞、以及变性高密度脂蛋白的测定方法和测定试剂盒。
技术介绍
血液中的胆固醇中，有所谓的好胆固醇(高密度脂蛋白；HDL：HighDensityLipoprotein)和所谓的坏胆固醇(低密度脂蛋白；LDL：LowDensityLipoprotein)。在血液中它们的浓度和中性脂肪一起作为健康诊断的指标被通用。原本的HDL以主要构成蛋白ApoAI和磷脂作为主成分，不仅抑制LDL的氧化，还通过NO的增加减轻由氧化LDL引起的细胞毒性，发挥抗动脉硬化效果。然而，HDL也受到氧化等的修饰。已知动脉硬化患者的血液中存在高数值的变性HDL。非专利文献1公开，冠状动脉疾病患者的变性HDL增加，其通过LOX-1作用于血管。已知变性HDL不仅失去了原本HDL所具有的抗动脉硬化作用，在动脉硬化的发病、进展方面也很重要。非专利文献2公开，在人的动脉硬化灶中大量地积蓄有HDL的载脂蛋白ApoAI发生了变性的HDL。这些结果是通过实际的患者所测定的，因此认为变性HDL在人的病态方面有着重大的意义。因此，即使在好胆固醇中变性HDL也可能是动脉硬化等各种疾病的原因，因此不仅HDL的量，还需要测定变性HDL的量和质。作为以往的变性HDL的测定方法，已知通过抗变性HDL抗体进行测定的测定法。这种方法只能测定抗体识别的特定的表位的量。而且问题在于，只是能测定表位的量，无法同时且以反映生理活性的形式测定关键的受到各种变性的HDL。此外，测定时的标准曲线制作的参照也有问题。例如，在测定由4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，HNE)修饰的HDL的情况下将HNE修饰的HDL用作参照，在测定由丙二醛(malondialdehyde，MDA)修饰的HDL的情况下将MDA修饰的HDL用作参照。因此，即使想用单一的测定法测定受到各种变性的HDL，不仅抗体不同，而且参照不同，因此实质上测定也是不可能的。为了解决该问题，有在铜离子等存在下进行HDL的氧化的方法(下文记为氧化HDL)。然而，氧化HDL及由HNE及MDA修饰而制备的HDL，不仅不稳定而无法长期保存，而且因为不稳定每次测定必需重新制作标准曲线。另外，容易产生批次间品质的偏差，重现地制备并测定是不可能的。因此，必需考虑标准品的批次差并校正试验结果，准确性存在着问题。因此，即使试验标本中真正的变性HDL的浓度相同，长期试验、大规模试验以及各测定试验间难以获得一定的测定值，测定值自身显示出的含义存在可信度的问题。现有技术文献非专利文献非专利文献1BeslerC.等：“HDL在eNOS活化通路上对冠状动脉疾病患者的不良影响的机制”，临床研究杂志，第121卷，第2693-708页，2011年非专利文献2HuangY.等：“人动脉粥样硬化中大量功能异常的载脂蛋白A1”，自然医学，第20卷，第193-203页，2014年
技术实现思路
专利技术所要解决的技术问题关于为了解决前述的问题的技术方案，本专利技术人反复进行了认真研究。结果发现，通过测定由LOX-1和抗ApoAI抗体同时识别的HDL，可以测定受到各种变性的HDL，以及，将针对LOX-1的抗体(抗LOX-1抗体)的LOX-1结合部位等之类的针对LOX-1特异性结合的蛋白与ApoAI融合而得的融合蛋白，不仅针对LOX-1和抗ApoAI抗体显示出与变性HDL同样的特异性结合性，而且可以作为稳定的标准品使用，完成了本专利技术。本专利技术是为了解决前述问题而完成的专利技术，本应为好胆固醇的HDL变成变性HDL并影响到动脉硬化的发病、进展，因此为了测定HDL的质而使用本专利技术，此外，可以同时识别受到各种变性的HDL，为了测定受体结合活性并测定生理活性本身而使用本专利技术，其目的为提供不含脂质的、可以长期保存的、可以重现地调制的、可以减少各测定试验间的偏差并提高可靠性的可以成为参照的融合蛋白，用于形成该融合蛋白的核酸及载体及细胞，以及精确地、重现性·可靠性良好地测定由LOX-1和抗ApoAI抗体识别的高密度脂蛋白的方法和测定试剂盒。解决技术问题所采用的技术方案为了达成前述目的而完成的本专利技术的融合蛋白中，在与凝集素样氧化LDL受体：LOX-1结合的LOX-1结合蛋白序列上，直接或隔着间隔子连接有载脂蛋白A1：ApoAI的全蛋白序列或部分片段蛋白序列。关于所述融合蛋白，例如，前述LOX-1结合蛋白序列为抗LOX-1抗体或该抗LOX-1抗体的LOX-1结合结构域序列。关于所述融合蛋白，前述抗LOX-1抗体或LOX-1结合结构域序列可以具有通过抗原抗体反应与LOX-1结合的抗体上的活性部位。关于所述融合蛋白，前述抗LOX-1抗体可以将前述活性部位作为Fv型抗体的活性部位。关于所述融合蛋白，前述ApoAI的部分片段蛋白序列优选包含人ApoAI中的氨基酸序号31-267aa的区域。为了达成前述目的而完成的本专利技术的核酸编码前述融合蛋白。为了达成前述目的而完成的本专利技术的载体导入有前述核酸。为了达成前述目的而完成的本专利技术的细胞具有前述载体。为了达成前述目的而完成的本专利技术的标本试样中的变性高密度脂蛋白的测定方法为基于变性高密度脂蛋白针对LOX-1和抗ApoAI抗体的结合的变性高密度脂蛋白的测定方法，其中，将权利要求1-3中任一项所记载的融合蛋白作为变性高密度脂蛋白的标准品使用，并且通过光学检测和/或放射剂量检测，通过与前述标准品的比较求出前述标准品和标本试样中的变性高密度脂蛋白。为了达成前述目的而完成的本专利技术的变性高密度脂蛋白测定试剂盒为基于变性高密度脂蛋白针对LOX-1和抗ApoAI抗体的结合的变性高密度脂蛋白的测定试剂盒，其用于将前述融合蛋白作为变性高密度脂蛋白的标准品使用，并且通过光学检测和/或放射剂量检测进行测定。所述变性高密度脂蛋白测定试剂盒用于通过光学检测和/或放射剂量检测，通过与前述标准品的比较求出标本试样中的前述变性高密度脂蛋白的浓度和质。所述变性高密度脂蛋白测定试剂盒优选进一步包含LOX-1和抗ApoAI抗体。关于所述变性高密度脂蛋白测定试剂盒，例如，前述标本试样为全血、血浆或血清。专利技术效果本应为好胆固醇的HDL变成变性HDL并影响到动脉硬化的发病、进展，因此为了测定变性HDL的质而将本专利技术的融合蛋白用作成为测定参照的普适性标准品。所述融合蛋白为不含脂质的人工融合重组蛋白，是可以长期保存的，可以重现地制备的，用于对于从人采集的全血以及其处理后的血浆、血清之类的标本试样，即使测定日期及测定时间不一样，也减少各测定试验间的偏差，提高可靠性，得到具有可信度的实测值的标准品。以往的变性脂质的测定有因为脂质的不稳定性而难以测定的问题，另外必需迅速处理标本试样。尽管标本样品自身的不稳定性问题可以通过保存方法的合理化以及测定时间的缩短来本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.融合蛋白，其特征在于，在与LOX-1结合的LOX-1结合蛋白序列上，直接或隔着间隔子连接有ApoAI的全蛋白序列或部分片段蛋白序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180214 JP 2018-0240071.融合蛋白，其特征在于，在与LOX-1结合的LOX-1结合蛋白序列上，直接或隔着间隔子连接有ApoAI的全蛋白序列或部分片段蛋白序列。


2.如权利要求1中所述的融合蛋白，其特征在于，所述LOX-1结合蛋白序列为抗LOX-1抗体或其LOX-1结合结构域序列。


3.如权利要求2中所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗LOX-1抗体或LOX-1结合结构域序列具有通过抗原抗体反应与LOX-1结合的抗体上的活性部位。


4.如权利要求3中所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗LOX-1抗体将所述活性部位作为Fv型抗体的活性部位。


5.如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，所述ApoAI的部分片段蛋白序列包含人ApoAI中氨基酸序号31-267aa的区域。


6.核酸，其特征在于，编码权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白。


7.载体，其特征在于，导入有权利要求6中所述的核酸。


8.细胞，其特征在于，具有权利要求7中所述的载体。


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【专利技术属性】
技术研发人员：泽村达也，垣野明美，
申请(专利权)人：国立大学法人信州大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP