一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法技术

一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法，属于生物技术领域。利用在线软件ORF Finder预测lncRNA‑BMP4可能存在的开放阅读框并构建原核融合表达载体，通过Western Blot检测获得的诱导蛋白。本方法简单易行，思路清晰，操作可行性高，在普通研究室就能完成。本发明专利技术将lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的研究扩展到家禽领域，并准确定位到lncRNA‑BMP4上，刷新了不同物种中lncRNA通过编码小肽形成功能的范畴。

【技术实现步骤摘要】
一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法
本专利技术涉及一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法，属于生物

技术介绍
自Ingolia等在2009年通过Ribo-seq高通量测序发现体内候选转录本与核糖体的关联度很高，并且许多研究都报道lncRNA与核糖体有很强的相关性，但不是所有的lncRNA都是主动翻译的。目前已发现了许多由lncRNA上的sORFs编码的小肽，但只有少数被描述过生物学功能。这些小肽通常是保守的，并广泛参与了生物学过程。Huang等报道了lncRNAHOXB-AS3编码产生一个53个氨基酸的保守多肽，该多肽能够抑制结肠癌细胞的生长、克隆形成和侵袭转移，但lncRNA本身不发挥功能。除此以外，小肽也参与其他生物学过程。在K562和HEK293T细胞系中，Lima等通过蛋白组学方法鉴定了小肽NOBODY，该小肽通过与mRNA的脱帽蛋白复合物相互作用来调控P-bodymRNA的加工。然而到目前为止，在家禽上未有报道，且仍未找到通过编码小肽参与家禽PGCs生成的关键lncRNA。
技术实现思路
本专利技术旨在针对上述现有技术的不足，提供一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法。本专利技术的技术方案如下：利用在线软件ORFFinder预测lncRNA-BMP4可能存在的开放阅读框并构建原核融合表达载体，通过WesternBlot检测获得的诱导蛋白。进一步的，将ORF连入pcDNA-3.1载体中，构建小肽过表达载体oeORF；将突变了ORF起始密码子的lncRNA-BMP4连入pcDNA-3.1载体中，构建骨架链过表达标签载体oelnc-ORFmut。在ESCs向PGCs诱导过程中通过细胞形态学观察类胚体形成，qRT-PCR检测PGCs形成相关基因，间接免疫荧光检测PGCs标记蛋白，流式细胞分析检测PGCs阳性细胞率等方法检测小肽和lncRNA-BMP4骨架链在PGCs形成过程中的功能。在ESCs、PGCs中转染oe-ORF，通过Chip实验验证小肽是否作为转录因子结合在BMP4启动子区域。双荧光素酶验证小肽对BMP4启动活性的影响。本专利技术的有益效果如下：本方法简单易行，思路清晰，操作可行性高，在普通研究室就能完成。实验者两个月就能完成。本专利技术将lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的研究扩展到家禽领域，并准确定位到lncRNA-BMP4上，刷新了不同物种中lncRNA通过编码小肽形成功能的范畴。具体实施方式本专利技术中所需原材料（括号为厂商）：DMEM高糖培养基（Hyclone），FBS(Gibco),青链霉素（碧云天），KO-DMEM（Gibco）,鸡血清（Gibco），非必须氨基酸（sigma），β-巯基乙醇（sigma），hSCF(sigma)，bfgf（sigma），Lif（密理博），BMP4(Prospec)，Cvh（abcam），TRIzol、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自北京天根公司。FuGENE®HDTransfectionReagen和双荧光素酶报告基因检测系统（Promega），BL感受态、超级感受态、引物合成及测序均由北京擎科生物公司完成。PET-28a（+）载体由实验室保存。本专利技术中所需培养基配方为：普通培养基配方：90%高糖DMEM培养基中添加10%FBS，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。因子培养基配方：85%KO-DMEM培养基中添加10%FBS，2.5%鸡血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，0.4μmol/L非必需氨基酸，2mmol/L谷氨酰胺，0.1mmol/Lβ-巯基乙醇，10ng/μL鼠LIF，10ng/μLbFGF，5ng/mLhSCF。本专利技术具体步骤为：1.检测lncRNA-BMP4编码蛋白的能力利用在线软件ORFFinder预测lncRNA-BMP4可能存在的开放阅读框。根据预测所得的ORF，设计扩增引物并引入酶切位点EcoRI和XhoI，进行1.5%凝胶电泳扩增，分别将ORF的PCR扩增产物和PET-28a（+）载体进行连接，转化后测序；将构建好的融合表达载体，转化进入BL感受态中，涂板后挑取固体培养基上出现的单个菌落扩摇，当OD值达到0.6时，加入2mM的IPTG诱导表达。再分别继续26℃摇床培养3h，离心去上清后，给菌块称重，加入10mL/克菌块的蛋白抽提剂I，漩涡震荡后室温孵育20min。再离心收集上清即为诱导获得蛋白，使用BCA法测定获得蛋白浓度，WesternBlot检测蛋白表达。验证小肽和lncRNA-BMP4骨架链功能分离ESCs，在因子培养基中培养24h，待生长状态良好时，进行质粒转染，共分为4组。一组转染lncRNA-BMP4过表达载体，一组转染小肽过表达载体oeORF，一组转染骨架链过表达载体oelnc-ORFmut，还有一组做空白对照。24h后将因子培养基更换为BMP4诱导培养基，更换时记为第0d，在诱导的0、2、4、6d分别取样进行相关实验的检测：1)在2、4、6d时通过荧光倒置显微镜分别观察各组类胚体出现的数量，并拍照记录。2)收集诱导的0、2、4、6d细胞，TRIzol法提取RNA，反转录为cDNA，再以β-actin为内参，参照天根公司SuperReal彩色荧光定量预混试剂(SYBRGreen)说明书进行荧光定量检测PGCs形成过程中相关基因的表达3)在BMP4诱导的第4d，分别对各组进行间接免疫荧光分析，各组细胞分别经过固定、透膜、封闭后，孵育一抗过夜，清洗后换成二抗，最后用DAPI复染，在荧光倒置显微镜下观察不同荧光通道并拍照记录。4)在BMP4诱导的第4d，分别对各组进行流式细胞分析，各组细胞分别经过固定、透膜、封闭后，孵育一抗过夜，清洗后换成二抗，2h后将各组细胞分别上机检测阳性细胞率。检测小肽对BMP4启动子活性的作用一、Chip验证小肽结合在BMP4启动子区域（1）交联：分别收集各组细胞，培养基调整至8mL，加入500μL的16%甲醛使工作液浓度为1%，室温孵育10min。再加入800L10×甘氨酸，冰上孵育5min后，1000r/min离心5min，弃上清。使用含蛋白酶抑制剂的PBS清洗两遍后以同样转速收集细胞沉淀。加入1mLSDS细胞裂解液重悬细胞，分装成三管保存于-80℃。（2）超声波破碎DNA：将1中分装的细胞裂解液在冰水混合物中准备超声，超声5s，关停10s，共重复五分钟，防止过热。结束后以12000r/min离心10min，弃沉淀。取上清100μL进行后续实验。（3）交联蛋白/DNA：在上一步破碎的IP样品中加入900μL含蛋白酶抑制剂II的稀释缓冲液，然后将其分为IgG组、阳性对照组和目的抗体组。每组加入60μLG琼脂糖蛋白，4℃孵育1h后，5000r/min沉淀琼脂糖。取上清10uL作为Input。收集剩余上清，在IgG组中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法，其特征是，利用在线软件 ORFFinder预测lncRNA-BMP4 可能存在的开放阅读框并构建原核融合表达载体，通过 WesternBlot 检测获得的诱导蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法，其特征是，利用在线软件ORFFinder预测lncRNA-BMP4可能存在的开放阅读框并构建原核融合表达载体，通过WesternBlot检测获得的诱导蛋白。


2.如权利要求1所述的一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法，其特征是，将ORF连入pcDNA-3.1载体中，构建小肽过表达载体oeORF；将突变了ORF起始密码子的lncRNA-BMP4连入pcDNA-3.1载体中，构建骨架链过表达标签载体oelnc-ORFmut；
在ESCs向PGCs诱导过程中通过细胞形态...

【专利技术属性】
技术研发人员：左其生，姜景译，李碧春，金晶，袁霞，张晨，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32