一种产犬α-干扰素的重组菌的构建方法及其应用技术

本发明专利技术实施例公开了一种产犬α‑干扰素的重组菌的构建方法及其应用。本发明专利技术实施例还提供一种犬α‑干扰素的制备方法，其包括以下步骤：将所述的构建方法得到的产α‑干扰素的重组菌进行发酵培养，得到发酵产物，从发酵产物中制得α‑干扰素。本发明专利技术实施例中，表达犬α‑干扰素的重组菌株，首先目的基因合成时，将其31位的碱基由C变为T，这样后期翻译的氨基酸就由精氨酸转换为半胱氨酸，同时在3’端设计加入了半胱氨酸序列，半胱氨酸作用为可形成二硫键，改变蛋白空间构象，促进目的蛋白的可溶性表达。

【技术实现步骤摘要】
一种产犬α-干扰素的重组菌的构建方法及其应用
本专利技术实施例涉及生物
，具体涉及一种产犬α-干扰素蛋白的重组菌的构建方法及其应用。
技术介绍
干扰素(IFN)是一类非常重要的细胞因子，它可以抵抗病毒感染，抑制肿瘤生长和调节机体免疫功能的作用。IFN蛋白家族基于它们的基因序列、染色体定位和受体特异性分为三型：I型包括IFN-α，-β，-ε，-ω，-κ等亚型；II型干扰素由单基因家族IFN-γ构成，又称为免疫干扰素；Ⅲ型是一种新发现的细胞因子，称为IFN-λ。其中IFN-α的抗病毒活性最强，α干扰素(IFN-α)分子的不同亚型由165～172个氨基酸组成，分子量约在19kDa左右。目前，犬干扰素IFN-α、IFN-β、IFN-γ亚型均已有基因序列报道，并在原核或真核表达系统中实现重组表达，表达产物具有抗病毒活性。但是，现有技术中，重组犬α干扰素的表达率低、表达量低以及比活性低的问题。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种产犬α-干扰素的重组菌的构建方法及其应用，以解决现有技术中重组犬α干扰素的表达率低、比活性低问题。为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：一种产犬α-干扰素的重组菌的构建方法，包括将犬α-干扰素基因的上游端连接酰基载体蛋白基因，下游端连接麦芽糖结合蛋白基因形成含犬α-干扰素基因融合基因，将所述融合基因导入大肠杆菌，得到所述产犬α-干扰素的重组菌。优选的，所述犬α-干扰素基因为如下a1)或a2)或a3)：a1)如SEQIDNO：1所示的序列；a2)严格条件下与a1)限定的DNA分子杂交且编码所述α-干扰素的DNA分子；a3)与a1)或a2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述α-干扰素的DNA分子。优选的，所述犬α-干扰素基因通过重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP导入所述大肠杆菌；所述重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP为将所述融合基因的DNA分子替换XhoI和NdeI酶切位点之间的小片段得到的载体。优选的，所述重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP构建过程为：将所述α-干扰素基因DNA分子替换pET30a(+)载体XhoI和NdeI酶切位点之间的小片段得到重组表达载体pET-CaIFN-α；将所述酰基载体蛋白基因DNA分子插入到所述重组表达载体pET-CaIFN-α的XhoI酶切位点处得到重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α；将麦芽糖结合蛋白基因DNA分子插入到所述重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α的NdeI酶切位点处得到重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP。优选的，所述大肠杆菌为DH5α。如下(1)或(2)所述生物材料：(1)权利要求1-5任一所述方法构建得到的产犬α-干扰素的重组菌；(2)权利要求2所述的犬α-干扰素基因；以及含有所述犬α-干扰素基因的表达盒、重组载体和重组菌，也属于本专利技术实施例保护的范围。所述的生物材料在制备犬α-干扰素中的应用，也属于本专利技术实施例保护的范围。本专利技术实施例还提供一种犬α-干扰素的制备方法，其包括以下步骤：将所述的构建方法得到的产α-干扰素的重组菌进行发酵培养，得到发酵产物，从发酵产物中制得α-干扰素。优选的，所述发酵培养的方法包括以下步骤：将权利要求1-5任一所述的方法构建得到的产α-干扰素的重组菌接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，于37℃振荡培养至OD600达到0.6～1.0，加IPTG至终浓度为1mmol/L诱导培养5h。优选的，所述LB培养基中，添加质量分数为0.6％的甘氨酸。本专利技术实施例的犬α-干扰素的重组菌BL21(DE3)/pETCaIFN-α，该重组菌pET-ACP-CaIFN-α-MBP为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，于2019年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.18944。本专利技术实施例具有如下优点：本专利技术实施例中，表达犬α-干扰素的重组菌株，首先目的基因合成时，将其31位的碱基由C变为T，这样后期翻译的氨基酸就由精氨酸转换为半胱氨酸，同时在3’端设计加入了半胱氨酸序列，半胱氨酸作用为可形成二硫键，改变蛋白空间构象，促进目的蛋白的可溶性表达。本专利技术实施例利用分子克隆技术构建pET-ACP-CaIFN-α-MBP融合表达载体，其中ACP为酰基载体蛋白为大肠杆菌基因组中的一个酸性短肽，由77个氨基酸组成的小分子肽链，它第37位的丝氨酸残基与它的辅基(磷酸泛酰巯基乙胺)上的磷酸基团相连，其辅基另一端的－SH基又与脂酰基通过硫脂键相连从而使ACP携带上脂酰基。大肠杆菌ACP可促进蛋白质的溶解性，其具备酸性蛋白融合标签的几个关键特性，如分子小、酸度大和细菌内源性。MBP标签不仅可以促进蛋白质的溶解性，促溶范围广、效率高、易于纯化，并且与目的蛋白分离后，目的蛋白很容易恢复其天然构象，可增加目的蛋白的稳定性。在菌株发酵过程中，在培养基中添加了甘氨酸，其作用一方面可以提高目的蛋白表达量，另一方面可以促进蛋白以可溶形式表达。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。图1为本专利技术实施例提供的重组表达载体pET-CaIFN-α双酶切图，其中，M：DL5000marker，1:酶切片段，2：水对照；图2为本专利技术实施例提供的重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α的PCR产物电泳图，其中，M：DL1500marker，1：ACP-CaIFN-αDNA片段的PCR产物，2：水对照；图3为本专利技术实施例提供的重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP的PCR产物电泳图，其中，M：DL2000marker；1：ACP-CaIFN-α-MBP片段的PCR产物；2：水对照；图4为本专利技术实施例提供的α-干扰素目的蛋白的电泳图，其中，M：蛋白Marker；1～6：分别为第1代、第1代、第15代、第20代、第25代和第30代pET-ACP-CaIFN-α-MBP重组菌；7：未诱导表达菌体；图5为本专利技术实施例的96孔细胞培养板加样示意图；图6为本专利技术实施例的不同处理方法构建的重组表达载体的蛋白表达量的SDS-PAGE电泳检测图，其中，泳道1：D1重组菌株；泳道2：D2重组菌株；泳道3：D3重组菌株；泳道4：D4重组菌株、泳道5：pET-ACP-CaIFN-α-MBP重组菌株培养发酵过程培养基中未添加0.6％的甘氨酸；泳道6：pET-ACP-CaIF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产犬α-干扰素的重组菌的构建方法，包括将犬α-干扰素基因的上游端连接酰基载体蛋白基因，下游端连接麦芽糖结合蛋白基因形成含犬α-干扰素基因融合基因，将所述融合基因导入大肠杆菌，得到所述产犬α-干扰素的重组菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种产犬α-干扰素的重组菌的构建方法，包括将犬α-干扰素基因的上游端连接酰基载体蛋白基因，下游端连接麦芽糖结合蛋白基因形成含犬α-干扰素基因融合基因，将所述融合基因导入大肠杆菌，得到所述产犬α-干扰素的重组菌。


2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，
所述犬α-干扰素基因为如下a1)或a2)或a3)：
a1)如SEQIDNO：1所示的序列；
a2)严格条件下与a1)限定的DNA分子杂交且编码所述α-干扰素的DNA分子；
a3)与a1)或a2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述α-干扰素的DNA分子。


3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，
所述犬α-干扰素基因通过重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP导入所述大肠杆菌；
所述重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP为将所述融合基因的DNA分子替换XhoI和NdeI酶切位点之间的小片段得到的载体。


4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，
所述重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP构建过程为：
将所述α-干扰素基因DNA分子替换pET30a(+)载体XhoI和NdeI酶切位点之间的小片段得到重组表达载体pET-CaIFN-α；
将所述酰基载体蛋白基因DNA分子插入到所述重组表达载体pET-CaIFN-α的Xh...

【专利技术属性】
技术研发人员：李振义，杜金玲，白俊岩，张秀军，王顺山，张传林，张志军，孙林，郭鑫，
申请(专利权)人：北京宝易生物技术有限公司，烟台市宝盈生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11