一种肝细胞冻存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术一种肝细胞冻存液及其制备方法和应用，所述冻存液包括以下组分：二甲基亚砜、葡萄糖、人重组白蛋白、维生素C、维生素E、羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、细胞缓冲液和氨基酸混合液。该冻存液避免了胎牛血清的使用，减少了对细胞治疗的不良影响，且成本低、成分稳定，制备方法简单，可规模化生产。可规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种肝细胞冻存液及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞冻存液
，特别涉及一种肝细胞冻存液及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]细胞治疗是指利用具有某些特定功能的细胞，采用生物工程方法通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。其技术发展使得肿瘤，白血病等疾病的治疗的疾病有了新的方法。
[0003]其中L
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02细胞建系鉴定于1980年(叶秀珍等，1980)。该细胞是一株正常肝细胞系，具有典型的肝细胞形态学特征，其细胞功能与正常肝细胞相似，是肝病细胞治疗中的种子细胞。L
‑
02细胞通过细胞治疗技术在肝病治疗中可以发挥重要辅助作用。
[0004]目前，肝细胞冻存液中均含有胎牛血清。但是，由于细胞治疗中细胞与人体有接触，而胎牛血清在其中有不确定因素，可能会影响细胞治疗效果。即使离心除去冻存液，也不能完全去除胎牛血清中的影响，会在一定程度上影响后续细胞治疗的效果。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种肝细胞冻存液，该冻存液不含有胎牛血清，能进一步减少肝细胞治疗在临床上的不安全因素，同时还能维持肝细胞的细胞存活率和生物活性。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]一种肝细胞冻存液，包括以下组分：体积分数5％～10％的二甲基亚砜，体积分数为10～15％的羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液，0.5～2.0g/L的葡萄糖，35～50g/L的人重组白蛋白，30～120μmol/L的维生素C，10～50μmol/L的维生素E，以及余量的混合溶液，所述混合溶液中细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比1:1～2。
[0008]优选的，所述细胞缓冲液的组分为：6800～8000mg/L NaCl、300～400g/L KCl、140～200mg/L CaCl2、95～100mg/L无水MgSO2、100～130mg/L Na2HPO4、40～55mg/L KH2PO4以及余量无菌水，所述细胞缓冲液的pH为7.1～7.6且其渗透压为250～290mOsm/L。
[0009]优选的，所述氨基酸混合液中含有：5～7.5mg/L甘氨酸、7～9mg/L L
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丙氨酸、40～50mg/L L
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缬氨酸、45～55mg/L L
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亮氨酸、45～55mg/L L
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异亮氨酸、25～35mg/LL
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苯丙氨酸、8～13mg/L L
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脯氨酸、8～13mg/L L
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色氨酸、8～13mg/L L
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丝氨酸、30～40mg/L L
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络氨酸、12～20mg/L L
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蛋氨酸、280～300mg/L L
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谷氨酰胺、25～35mg/L L
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胱氨酸、12～15mg/L L
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天冬酰胺、120～130mg/L L
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精氨酸、70～75mg/L L
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赖氨酸、40～45mg/L L
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组氨酸、12～15mg/L L
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天门冬氨酸、13～15mg/L L
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谷氨酸、0.5～1.8g/L亚硫酸氢钠、11～15g/L山梨醇，所述氨基酸混合液的溶剂为无菌水。
[0010]本专利技术还提供了制备上述肝细胞冻存液的方法，具体包括以下步骤：
[0011]S1、将细胞缓冲液中的各组分原料溶于无菌水中，搅拌混匀，调节pH至7.1～7.6，
灭菌得到细胞缓冲液；
[0012]S2、取各类氨基酸和亚硫酸氢钠溶于含有山梨醇的无菌水溶液中，搅拌均匀即得氨基酸混合液；
[0013]S3、将步骤S1所述细胞缓冲液与步骤S2所述氨基酸混合液按比例混合，搅拌均匀后，加入葡萄糖、人重组白蛋白、维生素C、维生素E、羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液，搅拌混匀后使其渗透压为250～290mOsm/L，除菌，再与二甲基亚砜混合即得肝细胞冻存液。
[0014]本专利技术提供的肝细胞冻存液在冻存肝细胞的应用中，无菌条件下，每1mL冻存液中保存的肝细胞数量为1～1.5
×
107个，储存在细胞冻存管反应器中，按照梯度降温法进行冻存。
[0015]本专利技术的有益效果为：本专利技术通过多种组分的互相配合、形成了成分稳定、营养物质多远、溶液渗透体系缓冲力强的针对于肝细胞的冻存液。该冻存液在冻存肝细胞时，不仅可以为肝细胞提供各种营养、为肝细胞提供保护，还能维持细胞的活性。而且，本专利技术的肝细胞冻存液完全避免了使用胎牛血清，使得肝细胞在冻存和解冻，包括后续培养的过程中接触其他生物的血清，去除了可能引起不良生物反应的因素，在细胞治疗过程中能更好的发挥其功效；同时，待患者病程好转过程中也不会引起机体的不良反应，降低了其对机体的副作用，使其在后续的临床使用中发挥更好的效果。本专利技术的肝细胞冻存液成本低廉，安全，无毒副作用，且制备过程简便，能在短时间内大量配置，可规模化生产。
具体实施方式
[0016]下面通过具体的实施例对本专利技术的技术方案进行详细的说明，所举实例只用于解释本发专利技术，并非同于限定本专利技术的范围。
[0017]实施例1
[0018]本实施例的肝细胞冻存液的组分为：5％(体积分数)的二甲基亚砜、0.5/L的葡萄糖、35g/L人重组白蛋白、30μmol/L维生素C、10μmol/L维生素E、10％(体积分数)羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、余量的混合溶液，且混合溶液中细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比为1:1。
[0019]细胞缓冲液中各组分含量为：6800mg/L NaCl、300g/L KCl、140mg/L CaCl2、95mg/L无水MgSO2、100mg/L Na2HPO4、40mg/L KH2PO4、余量的无菌水，将细胞缓冲液的pH调节为7.1，其渗透压含量为250mOsm/L。
[0020]氨基酸混合液中各组分含量为：5mg/L甘氨酸、7mg/L L
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丙氨酸、40mg/L L
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缬氨酸、45mg/L L
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亮氨酸、45mg/L L
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异亮氨酸、25mg/L L
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苯丙氨酸、8mg/L L
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脯氨酸、8mg/LL
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色氨酸、8mg/L L
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丝氨酸、30mg/LL
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络氨酸、12mg/L L
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蛋氨酸、280mg/L L
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谷氨酰胺、25mg/L L
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胱氨酸、12mg/L L
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天冬酰胺、120mg/L L
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精氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液包括：体积分数5％～10％的二甲基亚砜，体积分数为10～15％的羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液，0.5～2.0g/L的葡萄糖，35～50g/L的人重组白蛋白，30～120μmol/L的维生素C，10～50μmol/L的维生素E，以及余量的混合溶液，所述混合溶液中细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比1:1～2。2.根据权利要求1所述的肝细胞冻存液，其特征在于，所述细胞缓冲液的组分为：6800～8000mg/L NaCl、300～400g/L KCl、140～200mg/L CaCl2、95～100mg/L无水MgSO2、100～130mg/L Na2HPO4、40～55mg/L KH2PO4以及余量无菌水，所述细胞缓冲液的pH为7.1～7.6且其渗透压为250～290mOsm/L。3.根据权利要求1或2所述的肝细胞冻存液，其特征在于，所述氨基酸混合液中含有：5～7.5mg/L甘氨酸、7～9mg/L L
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丙氨酸、40～50mg/L L
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缬氨酸、45～55mg/L L
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亮氨酸、45～55mg/L L
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异亮氨酸、25～35mg/L L
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苯丙氨酸、8～13mg/L L
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脯氨酸、8～13mg/L L
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色氨酸、8～13mg/L L
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丝氨酸、30～40mg/L L

【专利技术属性】
技术研发人员：闵娅兰，周平，王军，刘路，郑飞，王依林，
申请(专利权)人：武汉仝干医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：