用于多重基因分型的多样品索引制造技术

一种通过用多个探针组接触样品来测定多种样品中感兴趣的多种核苷酸序列的存在且同时保持每种样品标识的方法。所述探针设计用于指示复杂混合物中感兴趣序列的存在和包含感兴趣序列的样品的标识。所述方法的应用包括复杂样品中的基因分型、表达分析和个体种类的鉴定。还提供所述方法中使用的探针组的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于多重基因分型的多样品索引
技术介绍
本专利技术涉及分子生物学，更特别地涉及检测数种样品中许多感兴趣的核苷酸序列。多重测定可以检测单个样品中的许多序列。然而，当涉及许多样品时，进行多重测定可能劳动强度大且昂贵。因此，需要一种检测方法，其可以检测一些单个样品的每个中的许多序列，报告每个感兴趣序列的存在或不存在，及将该结果与单个样品的标识相关联。专利技术简沭本专利技术提供测定多个样品中感兴趣的多个核苷酸序列的存在且同时保持每种样品标识的方法。所述方法可用于许多应用，包括复式样品的基因分型、表达分析和个体种类的鉴定。 在本专利技术的一个实施方案中，用多个探针组接触每种样品。第一探针具有第一识别序列和与感兴趣序列的第一部分互补的第一杂交序列。第二探针具有与相同的感兴趣序列的第二部分互补的第二杂交序列和第二识别序列。如果第一杂交序列杂交感兴趣序列的第一部分，且第二杂交序列杂交相同的感兴趣序列的第二部分，则结合第一探针和第二探针。这也可以使用连接和/或延伸方法进行，比如采用G0ldenGate_试验设计。在另一个实施方案中，探针是在结合前帽化的或选择性终止的。结果得到了具有两个不相邻的识别序列的结合探针，所述序列比如通过与解码探针杂交、酶检测或配对末端测序来解码的。基于所述结合探针中存在的识别序列码，测定感兴趣序列的存在和包含感兴趣序列的样品的标识。还提供相关检测方法和试剂盒(kit)。附图说明附图是使用图解形式的实例来阐述本专利技术的广泛原理，便于向本领域普通技术人员解释。它们不意欲将本专利技术的范围限定到代表性的实施方案，或显示或省略本专利技术的任选特征。图I显示代表性的ASOl和LSO探针，其中ASOl和LSO形成单个探针组。对于第一个样品(样品ID I)，探针组提供用于每个感兴趣的SNP，例如SNPs 1、2、3、. . . 1024，因此探针组库提供用于样品ID I。另一个探针组库提供用于样品ID 2，等。在该图和随后的图中，多个ID序列的核苷酸序列由唯一的4位号码表不。.图2显示代表性的AS02探针，其可以任选地与图I中的探针组使用。图3a图解ASOl探针和LSO探针杂交到感兴趣序列，该序列包含第一 SNP等位基因，比如等位基因T( “SNPl/等位基因T”)，其存在于样品I中基因组DNA中。图3b显示如果样品I包含作为替代的SNPl/等位基因C则出现的AS02探针(和LSO探针)的另外的杂交。图4a和图4b图解分别由图3a和图3b中的杂交得到的杂交复合物。图5a和图5b图解分别从图4a和图4b的杂交复合物得到的两种结合探针。图5c显示寡核苷酸引物(la’，2a’，3a’)，其可以与探针的引物序列一起使用以扩增结合的探针。图6图解了结合探针的解码，其中识别序列提供样品ID、SNP ID和等位基因信息。图7图解基因分型，且在SBE反应中使用可逆终止子，接着连接以进行结合探针的测序。任选的步骤括在括号中。图8图解图7中方法的变型，其中“结合探针”是通过环化单个探针形成的。详细说明样品本专利技术提供用于测定样品中感兴趣的核苷酸序列存在或不存在的方法。换句话说，在该方法中使用的样品可以包含具有特定核苷酸序列的核酸。在一个方面，所述方法可以测定这些核苷酸序列是否包含预定的感兴趣的核苷酸序列，比如多态性的基因型等位基因。在另一个方面，所述方法可以测量特定核苷酸序列的不同水平，比如用于基因表达分 析。在另一个方面，所述方法可以检测特定种类或类型的序列的存在，以检测来自复杂样品的个体种类或类型的成员。如本文使用的术语“样品”指取自来源的多个物质，无论是否包含全部来源或其部分，比如代表性的部分。样品可以取自单个生物体，比如人类、非人类动物、植物或微生物，或者可以取自不同生物体的混合物，比如环境源。样品的来源可以来自哺乳动物或禽类家畜，或者来自其它农业来源或由种子、茎干和叶子或从根和块茎产生的。样品还可以包含对预期样品源而言外源性的物质，比如细菌或病毒病原体。然后，“多个样品”指两种或多种样品，比如来自多种不同的生物体，包括多种类的，或来自多种环境源。多个样品也可以包括来自单个来源的多种样品，比如来自不同的组织、器官或来自不同的部位(draws)、时间点或不同的样品制备方法或处理方法。本专利技术提供可以用于 2、4、8、12、16、20、32、48、96、128、384、1024、2048、4096、8192、16，384 或多于36，864个样品的方法。根据特定的应用，这样的样品通常包含某些核酸，且可以准备用于保存、富集或纯化核酸。可以认为每种样品具有独特的“标识”，其中信息标识符用于指定特定样品，且能够报告与单独的特定样品而不是在相同或其它试验中涉及的其它样品相关的信息。这使得按照所述方法获得的检测结果能够追溯到特定样品，即使当物理样品(或其衍生物)与其它样品(及其相应衍生物)在某些点结合或混合而不再是物理分离的或可辨别的时。因此，尽管与其它样品物理混合或信息混杂，当有关样品性质的信息可以追溯到原始物理样品时，“保持”了样品的标识。术语“核酸”指天然的、合成的或人工的多核苷酸，比如DNA或RNA，其具体化为核苷酸序列。核酸可以成碎片的(fragmented)、克隆的、复制的、扩增的或以其它方式衍生的或处理的。示例性的DNA种类包括基因组DNA(gDNA)、线粒体DNA和互补DNA(cDNA)。示例性的 RNA 种类包括信使 RNA(mRNA)、转移 RNA(tRNA) ,microRNA(miRNA)、小的干扰 RNA(siRNA)和核糖体RNA (rRNA)。本文描述的方法适于包含完整基因组、基本上完整的基因组、代表性基因组、具有基本上完整的基因组复杂性的表现或复杂性降低样品的核酸，比如其中某些序列或序列类型优选地富集的或表现的(represented)。在某些方面,核酸的复杂性为少于原始基因组的一半。将核酸固定到珠粒、表面比如流动细胞内表面、或其它固相底物是有利的。固定方法的实例包括共价键合、离子键合、亲和力键合和金属-螯合作用键合。当使用珠粒时，它们可以是磁性的、胶液的，或存在抗生蛋白链菌素(streptavidin)或生物素部分。核酸可以以许多方式连接至这样的固体载体。将纯化标记连接到核酸也是有利的。本文的“纯化标记”指可用于纯化核酸链的部分，通常连接到固体载体。合适的纯化标记包括结合配偶体对的成员。例如，标记可以是结合其结合配偶体的半抗原或抗原。在一个优选的实施方案中，结合配偶体可以连接至固体载体。例如，合适的结合配偶体对包括抗原(比如蛋白质或肽)和抗体(包括其片段，例如Fabs);蛋白质和小分子，包括生物素/抗生蛋白链菌素；酶和底物或抑制剂；其它蛋白质-蛋白质相互作用对；受体-配体；及碳水化合物和其结合配偶体。核酸和核酸-结合蛋白对也是有用的。在一个实施方案中，所述对的较小分子连接至核苷酸三磷酸盐(NTP)，用于结合探针或引物。优选的结合配偶体对包括生物素(或亚氨基-生物素)和抗生蛋白链菌素，digeoxinin和抗体。术语“感兴趣的核苷酸序列”(例如Id’ -2d’或3d’ -2d’ )可以指两种或多种接近的核苷酸，其中核苷酸的存在或不存在是研究者感兴趣的。在一个方面，感兴趣序列包括单个核苷酸查询，比如单个核苷酸多态性(SN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.07 US 61/267,3631.一种用于测定多个样品中感兴趣的多个核苷酸序列的存在且同时保持每种样品标识的方法，其包括步骤 (a)用多个探针组接触每个样品，每个探针组包含 第一探针，其具有第一识别序列和与感兴趣序列的第一部分互补的第一杂交序列，和 第二探针，其具有第二识别序列和与相同的感兴趣序列的第二部分互补的第二杂交序列； (b)如果第一杂交序列杂交感兴趣序列的第一部分，且第二杂交序列杂交相同的感兴趣序列的第二部分，则结合探针组的第一探针和第二探针； (C)解码多个结合探针的识别序列，其中保持每种样品的标识；和(d)基于每个结合探针中存在的识别序列码，确定感兴趣序列的存在和包含感兴趣序列的样品的标识。2.一种用于测定样品多个样品中感兴趣的多个核苷酸序列的存在且同时保持每种样品标识的方法，其包括步骤 (al)用多个探针组接触每种样品，每个探针组包含第一探针，其具有第一识别序列和与感兴趣序列的第一部分互补的第一杂交序列； (a2)用可逆的终止子延伸杂交的第一探针，从而得到终止的第一探针； (a3)帽化任何未延长的第一探针； (a4)反转在步骤(a2)中得到的探针的终止； (b)使(a4)的探针结合可连接的末端，形成结合的探针； (C)解码多个结合探针的识别序列，其中保持每种样品的的标识；和(d)基于每个结合探针中存在的识别序列码，确定感兴趣序列的存在和包含感兴趣序列的样品的标识。3.权利要求I或2的方法，其中所述样品来自相同生物体。4.权利要求I或2的方法，其中所述样品来自不同生物体。5.权利要求I或2的方法，其中所述样品来自不同种类。6.权利要求I或2的方法，其中所述样品包括具有基本上全基因组复杂性的DNA。7.权利要求I或2的方法，其中所述样品包括具有的复杂性少于原基因组一半复杂性的 DNA。8.权利要求I或2的方法，其中所述感兴趣序列包括至少一种单核苷酸多态性。9.权利要求I或2的方法，其中所述感兴趣序列包括至少一种甲基化多态性。10.权利要求2的方法，其中所述可连接的末端位于具有第二识别序列的第二探针上。11.权利要求I或10的方法，其中所述第一或第二识别序列为单个未分开的识别序列。12.权利要求I或10的方法，其中所述第一或第二识别序列包含用于识别样品和感兴趣序列的单独的子序列。13.权利要求I或10的方法，其中所述探针组进一步包括第三探针，其具有第三识别序列和与感兴趣序列处其它多态性互补...

【专利技术属性】
技术研发人员：建兵·范，K·冈德森，
申请(专利权)人：伊鲁米那股份有限公司，
类型：发明
国别省市：