基于抑制的对细胞克隆的高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种用于筛选对靶蛋白具有高水平表达的细胞的方法。所述方法包括向多个宿主细胞引入DNA构建体，所述DNA构建体编码靶蛋白和针对所述宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂；筛选带有该DNA构建体的宿主细胞，用于表达所述内源性可选标记物；和分离出所述可选标记物表达降低的细胞。本发明专利技术还公开了构造为在该宿主细胞中表达该靶蛋白和该抑制剂的DNA构建体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物技术和分子生物学，特别涉及细胞克隆的高通量筛选。
技术介绍
生成产生重组蛋白的细胞系的一个关键步骤是在将感兴趣的基因掺入宿主细胞后存活克隆的选择。为了エ业规模的生物生产，迫切需要稳定地结合了产品基因并产生大量蛋白产物的克隆。在异质种群中，重组基因结合到宿主基因组中是非常随机的事件。含有高拷贝数稳定结合的基因的细胞的比例会小于含有低拷贝数结合基因的细胞。高产的亚克隆稀有并易于被更快生长的非产或低产细胞所稀释。因此，需要筛选并测试许多孔(well)以分离具有増加的生产率的亚克隆。通常，有限的稀释方法冗长且耗吋。使用流式细胞术和细胞分选的选择方法的出现显著提高了可被筛选的细胞的数目。可以在短时间内筛选数百万细胞，并且可以从混合细胞群中分离亚群和单个细胞，即使其在该群中的频度低至10_6。流式细胞术与非荧光报告蛋白配合，用于对产生高水平靶蛋白的克隆的快速早期识别。己基于细胞表面蛋白表达，通过使用能够实现细胞分离的抗体和与配体结合的荧光染料，使其更加便利。例如，可以将细胞表面蛋白(不是通常地在宿主细胞表达)与作为报告分子(reporter)的革巴蛋白协调表达。在表面表达和产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.06.11 US 61/213,459;2010.06.03 US 12/792,9241.用于筛选对靶蛋白具有高水平表达的细胞的方法，其包括 向多个宿主细胞引入DNA构建体，所述DNA构建体编码靶蛋白和针对所述宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂，其中，所述DNA构建体构造为在所述宿主细胞内表达所述靶蛋白和所述抑制剂； 筛选带有该DNA构建体的宿主细胞，用于表达所述内源性可选标记物，和 分离出所述可选标记物表达降低的细胞。2.如权利要求I所述的方法，其中所述抑制剂选自由小干扰RNA(SiRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微 RNA(miRNA)、miRNA 与 shRNA 的杂种、和反义 RNA 组成的组。3.如权利要求I所述的方法，其中所述抑制剂为shRNA。4.如权利要求I所述的方法，其中所述内源性可选标记物为荧光标记物，且其中分离步骤包括用荧光活化细胞分选器(FACS)分选细胞。5.如权利要求I所述的方法，其中所述DNA构建体进ー步编码ニ氢叶酸还原酶(DHFR)，且其中所述宿主细胞为DHFR缺陷细胞。6.用于选择转基因表达细胞的高通量筛选方法，该方法包括 用负载至少ー种转基因和抑制荧光蛋白表达的干扰RNA的载体转染所述细胞； 測定被转染细胞中的荧光强度；和 分离其荧光強度低于未转染的细胞的荧光強度的细胞。7.如权利要求6所述的方法，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。8.如权利要求6所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟广，丁敏珮，
申请(专利权)人：台湾神隆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：