唾液酸在植物中的合成制造技术

提供了一种在植物中合成唾液酸的方法，以及能够合成唾液酸的植物。此外，还提供了一种在植物中产生唾液酸化的蛋白的方法。所述合成唾液酸的方法包括：提供一种包含编码N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列的植物，以及表达所述核苷酸序列从而合成唾液酸。所述植物还可以共表达编码差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白和唾液酸转移酶中的一种或多种的核苷酸序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及唾液酸在植物中的合成。此外，本专利技术提供了产生唾液酸的方法和植物，以及由这些植物产生的唾液酸化的蛋白。
技术介绍
对于重组药用蛋白的生产，植物是潜在的低成本并且无污染的工具。植物中生产的大多数重组蛋白与它们的哺乳动物对应物在氨基酸序列、构象和生物活性方面没有区别。此外，当哺乳动物糖蛋白在转基因植物中表达的时候能够被有效地糖基化。然而，由植物产生的分子上具有的N-聚糖与存在于动物糖蛋白上的N-聚糖是不同的(Lerouge et al.，1998)。这一点可能限制了从植物制备的药物的应用，这是因为除了缺乏哺乳动物型表位(例如唾液酸化序列)可导致它们被快速地从血流中清除之外，这些蛋白上的植物特异性糖表位会引起人的免疫反应(Bardor et al.，2003)。因此，对从植物制备的药物的N-糖基化进行控制是将它们用于治疗人类的前提条件。最近已经出现了植物内重塑方法，以用于获得具有与人类相容的糖类特征的来源于植物的抗体。一些方法包括植物抗体在内质网中的驻留(Ko et al. ,2003 ；Sriraman et al. ,2004, Triguero et al.，2005)，还有一些方法涉及用哺乳动物糖基转移酶来对植物进行转化。例如，通过用人β (I，4)_半乳糖转移酶来转化植物可以部分地将植物N-糖基化人源化(Palacpac et al. , 1999 ；Bakker et al. ,2001)。鼠类抗体在转化植物中的表达可以产生来源于植物的抗体，所述抗体具有的半乳糖基化特征与在相应的鼠IgG所观察到的特征类似(Bakker et al. ,2001)。哺乳动物IgG在位于Fe区的N-糖基化保守位点带有二天线(bi-antennary) N-聚糖。这些低聚糖被轻度唾液酸化，并且缺少末端Neu5Ac时也不会影响抗体的功能和稳定性。相反，大部分的其他血液循环糖蛋白具有唾液酸化的二天线N-聚糖、三天线 (tri-antennary)N-聚糖或四天线(tetra-antennary) N-聚糖。在这些聚糖上存在末端唾液酸是多种生物功能必需的，其中首要一点是调控所述蛋白在循环系统中的半衰期。不存在末端唾液酸时，糖蛋白会被肝的无唾液酸糖蛋白受体检测到并且被从血清中清除，使得这些蛋白在生物中存在很短暂且没有效力(Kelm and Schauer，1997)。因此，由植物制备的非唾液酸化的药物在注射至人体后可被快速地从血液中清除——例如来源于烟草的Epo在体外有生物活性而在体内无功能，这是因为它在到达红细胞生成组织之前就被从循环中去除(Matsumoto et al. ,1995)。通过人β (1，4)_半乳糖转移酶(一种利用内源UDP-Gal作为协同底物的转移酶) 的表达(Palacpac et al. , 1999 ；Bakker et al. , 2001),已经在植物中部分地实现将连接于植物抗体的N-聚糖重塑为类似人的N-聚糖。哺乳动物唾液酸转移酶已经被导入植物中，并且被证明有功能且被正确地定位于高尔基体上(Wee et al.，1998)。然而，没有观察到内源寡糖的唾液酸化。在植物中是否存在唾液酸以及唾液酸化机制仍然是有争议的问题。然而，Neu5Ac (在人体内存在的主要的唾液酸)以及其前体N-乙酰甘露糖胺(D-ManNAc)在植物中合成的量似乎不足以被检测(S6veno et al.，2004)。因此，将植物N-聚糖进行糖工程改造成唾液酸化寡糖需要能够催化Neu5Ac合成、激活和在高尔基体中转移的外源性酶的共表达。在哺乳动物和细菌中，Neu5Ac的合成代谢和分解代谢通过不同途径发生(Angata and Varki, 2002)。Neu5Ac的形成主要需要两类酶。通过在可逆反应中催化Neu5Ac分解成N-乙酰甘露糖胺(D-ManNAc)和丙酮酸，N-乙酰神经氨酸裂合酶(Neu5Ac裂合酶)参与唾液酸的分解代谢。在高浓度的D-ManNAc和丙酮酸下，上述平衡转向Neu5Ac合成的方向。 来自大肠杆菌的Neu5Ac裂合酶与葡糖胺2-差向异构酶活性相结合,被用于从D-GlcNAc大规模生产Neu5Ac (Maru et al.，1998)。或者，Neu5Ac合酶(例如NeuB)催化ManNAc与憐酸烯醇丙酮酸(PEP)的缩合，并且直接参与唾液酸的生物合成(在Tanner，2005中综述)。
技术实现思路
本专利技术涉及唾液酸在植物中的合成。此外，本专利技术提供了产生唾液酸的方法和植物，以及由这些植物产生的唾液酸化的蛋白。本专利技术的一个目标是提供改进的在植物中产生唾液酸的方法。根据本专利技术，提供了一种合成唾液酸——例如N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的方法 ⑷，包括i)提供包含编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的核苷酸序列的植物,所述核苷酸序列与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接，以及ii)使所述植物生长并且表达所述核苷酸序列，从而合成所述唾液酸。此外，在所述使植物生长的步骤后可以从所述植物中回收所述唾液酸。所述调控区可以选自于组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育相关的启动子。本专利技术还涉及上文定义的方法(方法A)，其中在所述提供植物的步骤中，所述植物还包含与在所述植物中有活性的一个或多个第二调控区可操作地连接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码下述一种或多种蛋白质差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、 CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶或唾液酸转移酶，并且所述第二核苷酸序列与所述核苷酸序列共表达。此外，所述第二调控区可以选自于组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育相关的启动子。本专利技术还涉及上文描述的方法(方法A)，其中为了在所述植物中表达，可以对编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac裂合酶的所述核苷酸序列，编码差向异构酶、CMP_Neu5Ac合酶或 CMP-Neu5Ac运载蛋白中的一种或多种的所述第二核苷酸序列，或者所述核苷酸序列和所述第二核苷酸序列两者进行密码子优化。本专利技术提供了一种产生目的蛋白的方法(B)，包括i)提供一种表达一个或多个第一核苷酸序列和编码目的蛋白的第二核苷酸序列的植物，所述第一核苷酸序列编码Neu5Ac合酶、Neu5Ac裂合酶、差向异构酶、CMP_Neu5Ac合酶、CMP-Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶，ii)使所述植物生长并且表达所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列，从而产生所述目的蛋白，其中所述目的蛋白是唾液酸化的。优选地，唾液酸化的目的蛋白包含二天线N-聚糖、三天线N-聚糖或四天线N-聚糖。本专利技术还涉及上文定义的方法(方法B)，其中所述唾液酸化的蛋白提取自所述植物。此外，所述唾液酸化的蛋白可以被分离和纯化。本专利技术提供了下述的植物、植物细胞或种子，它们包含编码Neu5Ac合酶或Neu5Ac 裂合酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列与与在所述植物中有活性的调控区可操作地连接。 所述植物、植物细胞或种子还可以包含与在所述植物中有活性的一个或多个第二调控区可操作地连接的第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码下述一种或多种蛋白质差向异构酶、CMP-Neu5Ac合酶、CMP_Neu5Ac运载蛋白、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶。此外，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：T·帕卡雷特，M·巴多，C·里霍，V·戈莫德，L·费伊，P·勒鲁格，S·阿奎恩，LP·韦齐纳，MA·达乌斯特，
申请(专利权)人：麦迪卡格公司，法国国家科研中心，鲁昂大学，
类型：发明
国别省市：