重组蜘蛛丝蛋白制造技术

本发明专利技术涉及重组蜘蛛丝蛋白，编码这些重组蜘蛛丝蛋白的核酸，以及适合于表达那些核酸的宿主。另外，本发明专利技术涉及聚集蜘蛛丝蛋白的方法和将所述蛋白质用在生物技术和/或药物领域和其它工业领域，特别是在制备汽车部件，在飞行器构建，在加工纺织品和皮革，以及在制备和加工纸等中的应用。

【技术实现步骤摘要】
重组蜘蛛丝蛋白 本申请是国际申请号PCT/EP2005/007968，国际申请日2005年7月21日，进入中国国家阶段日期为2007年2月12日，中国申请号为200580027435. 4，专利技术名称为“重组蜘蛛丝蛋白”的分案申请。本专利技术涉及重组蜘蛛丝蛋白，核酸，编码这些重组蜘蛛丝蛋白的核酸，以及适合于表达那些核酸的宿主。此外，本专利技术涉及聚集蜘蛛丝蛋白的方法和这些蛋白质在生物技术和/或药物和其它工业领域中的应用，特别地在制备汽车部件(automotive parts)，在飞行器构建中，在加工纺织品和皮革制品，以及在制备和加工纸，化妆品，食物，电子装置，药物递送等中的应用。在本申请中，使用下列缩写NR-非重复性的；Apr，氨苄青霉素抗性基因；IPTG，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；GdmCl，氯化胍(guanidinium chloride) ；GdmSCN，异硫氰酸胍；SDS，十二烷基硫酸钠； PAGE，聚丙烯酰胺凝胶电泳；Tris，三(羟甲基)氨基甲烷；⑶，圆二色性；r印-蛋白质，重复蛋白质；Da，道尔顿；cps，每秒计数；MRW，平均残基重量；n. d.，不确定。蜘蛛丝是显示优越物理性质的蛋白聚合物(1)。在不同类型的蜘蛛丝中，拖丝是被最集中研究的。拖丝的丝被圆网蜘蛛(orb weaving spiders)用于构建它们的网的框架和半径并作为总是拖在后面的生命线。为这些目的，需要高的拉伸强度和弹性。这些性质的组合导致与大多数其它已知材料相比，更高的韧性(1;2)。拖丝的丝通常由两种主要的蛋白组成，其主要结构具有共同的重复结构(3;4)。可以包含多到60个氨基酸的单重复单位的变化被重复数次来表示拖丝的丝序列的最大部分。这些重复单位表示有限组的独特的氨基酸基序。在所有的拖丝的丝重复单位中发现的一个基序是典型地6-9个丙氨酸残基的区组。在丝线中，数种聚丙氨酸基序形成晶态的折叠堆积，产生拉伸强度(5 ；6)。富含甘氨酸的基序诸如GGX或GPGXX采用柔性的螺旋状结构，其连接晶态区域并给线提供弹性(7)。此外，所有的被研究的拖丝的丝蛋白在它们的羧基端包含不显示明显的重复模式的区域(非重复的或NR-区域)。到目前为止，在最终的线中没有功能与这些区域相关。丝的体内装配是引入注意的过程。蜘蛛的拖丝丝蛋白在所谓的主要的壶腹腺中以多到50% (w/v) (8)的浓度贮存。尽管已经提出在主要的壶腹腺中关于这些蛋白质的“动态松散螺旋结构”(8)，更近的数据提示对于所述蛋白质的所谓A-区的随机卷曲构象，其代表所述腺体的最大部分(9 ；10)。高度浓缩的蛋白质溶液形成丝粘稠物(纺丝溶液(spinning solution))，其显示液态晶体的性质(11-13)。线的装配在粘稠物通过纺织导管的通道中开始，伴随水、钠和氯化物的提取(14 ； ㈤。同时，易溶离子钾和磷酸盐的浓度增加，PH从6.9降到6.3(14-16)。装配最终由机械应力引发，其由线被推出蜘蛛的腹部而导致(17)。出于一些目的，天然丝线不能直接使用，而必须溶解并且再装配成其它形态，诸如薄膜、泡沫、球体、纳米纤维、水凝胶等。已经关于丝的丝心蛋白进行了涉及由丝蛋白制备的薄膜的大部分研究，所述丝的丝心蛋白是衍生自家蚕家蚕蛾(Bombyx mori)的丝的主要蛋白质成分。丝的丝心蛋白薄膜可以从水溶液或包含六氟异丙醇(HFIP)、甲酸和三氟乙酸的溶液中铸塑成。在溶液中，根据所用的溶剂，丝的丝心蛋白倾向于采取螺旋或随机卷曲构象。当铸塑成薄膜时，蛋白质维持可溶性状态的构象或采取更多的富含β-折叠的构象。在大多数情形中，用甲醇处理薄膜导致折叠含量和结晶度的进一步增加。除了丝的丝心蛋白之外，还将其它的丝蛋白用于铸塑成薄膜。Vol Irath及同事研究从提取自蜘蛛N印hi la senegalensis的主要壶腹腺的蛋白质制成的薄膜。当从水溶液中制备时，这样铸塑成的薄膜主要包含随机卷曲构象的蛋白质。它们的结构在添加氯化钾后改变成β-折叠。此外，使用HFIP作为溶剂，从蜘蛛 Nephila clavipes的拖丝的丝蛋白MaSpI来源的合成丝蛋白质制备薄膜。在溶液中，蛋白质采取α-螺旋结构，当被铸塑成薄膜时，其改变为富含更多的β-折叠的构象。不幸的是，其氨基酸序列局限了从天然的丝的丝心蛋白产生功能性薄膜材料。由于包含硫醇、氨基或羧基基团的化学反应性氨基酸侧链的低丰度(< 1. 5% )，丝的丝心蛋白的选择性化学修饰仅可能是非常有限的。此外，在天然宿主中改变丝蛋白并因此改变薄膜的性质的遗传修饰则很慢。尽管蜘蛛丝蛋白的某些结构方面已经清楚，但是关于个体丝蛋白和它们的主要结构元件对于装配过程的贡献则知道的很少。关于花园蜘蛛十字园蛛(Aranus diadematus) 的两种主要的拖丝丝蛋白，ADF-3和ADF-4的竞争性研究揭示，尽管它们的氨基酸序列非常相似G)，它们显示相当不同的溶解度和装配特性尽管ADF-3甚至在高浓度仍是可溶的 (18)，ADF-4实际上是不可溶的，并且在特定条件下自装配为丝状结构(未公开的结果)。科学和商业利益促进了蜘蛛丝的工业规模生产的研究。由于蜘蛛的同种相残，天然的蜘蛛丝生产是不切实际的，而人工生产在获得足够的蛋白质产量和出众的线-装配中遇到问题。细菌的表达产生低蛋白水平，这可能是由于细菌和蜘蛛的不同的密码子选择导致的。具有适应于表达宿主的密码子选择的合成基因导致更高的产量，但是其合成的蛋白质显示与天然蜘蛛丝不同的性质。部分拖丝的丝cDNAs在哺乳动物细胞系中的表达确实产生了丝蛋白(例如ADF-3)，其可以以人工方式纺丝(spin)为“丝样”的线，尽管在品质上仍旧很差。W003060099涉及将生物丝蛋白纺丝为纤维的方法和装置。该专利技术特别用于从水溶液中纺丝重组的丝蛋白，并增加纤维的强度和制品的实用性从而使这些纤维的商业生产和应用是可实践的。其中，公开了在哺乳动物细胞，例如转基因的山羊乳腺细胞中表达蜘蛛丝蛋白。在细菌宿主中的真正的蜘蛛丝基因的表达-如上提及-是无效的04)，因为一些基因部分包含不能有效在细菌中翻译的密码子。此外，由于丝的重复性性质，通过PCR进行基因操作和扩增是困难的。为了研究蜘蛛丝蛋白的性质，使用具有适应于相应的表达宿主的密码子选择的合成DNA组件进行克隆策略。获得编码类似于蜘蛛丝的重复区的蛋白质的合成基因05- )。然而，发现这些蛋白质的设计都不包含在所有的拖丝的丝中发现的羧基端NR-区。因此，本专利技术的目的是提供具有提高的特性，如具体而言以高产量表达的提高的能力和提高的强度和柔性，即更好的质量的重组蜘蛛丝蛋白。CN 102532295 A此外，本专利技术的目的是提供可以方便地在已经了解的表达系统中表达的重组蜘蛛丝蛋白。本专利技术的另一个目的是提供用于聚集蜘蛛丝蛋白的改善的方法和由这些蛋白质形成线的方法。此外，本专利技术的目的是提供改善的纸、纺织品和皮革制品。另一个目的是提供新的蛋白质和基于蜘蛛丝蛋白的其它的材料诸如球体，纳米纤维，水凝胶，线，泡沫，薄膜以用在生物技术、药物、药学和食品应用，化妆品，电子装置中和用于其它的商业目的。这些目的通过独立权利要求的主题而得以实现。优选的实施方案在从属权利要求中提出。提供包含合成的重复蜘蛛丝蛋白序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2004.07.22 US 60/590,1961.重组蜘蛛丝蛋白，其包括a)一个或多个合成的重复性蜘蛛丝蛋白序列，其中所述合成的重复性序列包括5-50 个重复单位，并且其中(i)所述重复单位由氨基酸序列SEQID NO :3(组件A)组成，(ii)所述重复单位由氨基酸序列SEQID NO :4(组件Q)组成，(iii)所述重复单位由氨基酸序列SEQID NO :5(组件C)组成，(iv)所述重复单位由氨基酸序列SEQID N0:3(组件A)组成并且与由氨基酸序列SEQ ID N0:4(组件Q)组成的重复单位组合，或(ν)所述重复单位由氨基酸序列SEQ ID Ν0:4(组件Q)组成并且与由氨基酸序列SEQ ID Ν0:3(组件Α)组成的重复单位组合和与由氨基酸序列SEQ ID Ν0:4(组件Q)组成的重复单位组合，和还任选地包括b)一个或多个真正的非重复性蜘蛛丝蛋白序列，其中(i)所述非重复性蜘蛛丝蛋白序列由氨基酸序列SEQID N0:10(NR3)组成，或(ii)所述非重复性蜘蛛丝蛋白序列由氨基酸序列SEQID N0:11(NR4)组成。2.权利要求1的重组蜘蛛丝蛋白，其中编码所述真正的非重复序列的核酸序列被修饰从而使所述序列适应于在宿主中表达。3.权利要求2的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述核酸序列是编码氨基酸序列SEQID NO 10 (NR3)的SEQ ID NO 14 (NR3)，或所述核酸序列是编码氨基酸序列SEQ ID NO :11(NR4)的 SEQ ID NO :15(NR4)。4.权利要求1的重组蜘蛛丝蛋白，其中所述合成的重复序列是(AQ)12,(AQ)24, (QAQ)8 或 OlAQ) m5.权利要求1-3的重组蜘蛛丝蛋白，其中完整的重组蜘蛛丝蛋白包括式(QAQ)8NR3， (QAQ) 16NR3，(AQ) 12NR3，(AQ) 24NR3，C16NR4 或 C32NR4，(QAQ) 8，(QAQ) 16，(AQ) 12，(AQ) 24，C16 或 C32， 其中A代表氨基酸序列SEQ ID NO 3, Q代表氨基酸序列SEQ ID NO :4，C代表氨基酸序列 SEQ ID NO 5, NR3代表氨基酸序列SEQ ID NO :10，NR4代表氨基酸序列SEQ ID NO :11。6.核酸序列，其编码权利要求1-5的一项或多项的重组蜘蛛丝蛋白。7.载体，其包括权利要求6的核酸序列。8.权利要求7的载体，其通过将权利要求6的核酸序列克隆至图6的克隆载体而获得。9.权利要求8的载体，其中图6的克隆载体如SEQID NO 55所示。10.权利要求7的载体，其还包括一个或多个调节序列，其中所述载体是表达载体。11.权利要求7-10的载体，其是质粒载体或病毒载体。12.权利要求11的载体，其中所述病毒载体是杆状病毒系统或痘苗病毒载体系统。13.非人宿主，其已经用权利要求7-12中任一项的载体进行转化。14.权利要求13的宿主，其是原核细胞。15.权利要求14的宿主，其是大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ο16.权利要求13的宿主，其是真核细胞。17.权利要求16的宿主，其是哺乳动物细胞，植物细胞，酵母细胞或昆虫细胞。18.权利要求17的宿主，其中所述哺乳动物细胞是010，0)5，《61^，2931\冊!1或冊1(细胞。19.权利要求17的宿主，其中所述酵母细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)，白色念珠菌(Candida albicans)或多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)。20.权利要求17的宿主，其中所述昆虫细胞选自鳞翅目(L印idoptera)昆虫细胞。21.权利要求20的宿主，其中所述鳞翅目昆虫细胞来自Spo...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·沙伊贝尔，D·许梅里希，C·阿克朔特，
申请(专利权)人：AM丝绸有限责任公司，
类型：发明
国别省市：