本发明专利技术公开了一种定量检测急性心肌梗塞标志物肌酸激酶同工酶CK-MB的荧光免疫层析方法及其试剂盒。本发明专利技术的定量检测肌酸激酶同工酶的荧光免疫层析方法利用量子点优良的荧光特性，结合双色标记技术和免疫层析技术，在优化试纸条各组成部件的基础上，实现的荧光定量检测。与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明专利技术具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明专利技术试剂盒对CK-MB进行定量检测，适用于全血、血清和血浆样本的检测，可为心脑血管疾病诊断提供参考，广泛用于基层医院和诊所。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学检验领域，特别涉及一种定量检测急性心肌梗塞标志物肌酸激酶同工酶的荧光免疫层析方法及其试剂盒。
技术介绍
当前，心血管疾病在世界范围内已成为成年人最大的潜在杀手，仅在美国就有超过7000万人患有心脏病，每年大约有600万人因胸痛而进急诊室，每年急性心肌梗死(AMI) 的死亡人数超过了 50万，在我国，心血管疾病的患病率、发病率及其危险因素水平均呈不断上升趋势。近年来统计，心血管病的死亡率在人口死亡中占40%，已高于欧美国家，属心血管病高发国。因此，只有做到早预防、早发现及早救治，才能最大限度的防止致残、致死后果，最大限度的改善心血管患者的预后和生活质量。对心血管疾病，常用的检测指标为心肌酶谱系列。心肌酶是指心肌细胞内的酶类物质，具有催化心肌细胞代谢和调节心肌细胞电活动的作用。心肌酶谱包括天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同功酶MB (CK-MB)等。如果心肌细胞发生坏死、破裂，这些酶类就会释放人血液当中，使之升高。因此，心肌酶谱的升高程度可以间接衡量心肌细胞的损害程度。其中CK和CK-MB是灵敏度较高的指标，能在发病早期心肌尚未大面积坏死时，在患者血液中检测出来，第一时间为临床提供可靠资料。CK是由两种不同亚基(M和B)组成的二聚体，这样正常人体组织主要含3种同工酶，即CK-MM、CK-BB, CK-MB。CK-MM主要存在于肌肉细胞中，CK-BB主要存在于脑细胞中， CK-MB主要存在于心肌细胞中。CK-MB是目前常用的心肌损伤标志物，曾一度被视为诊断AMI的“金标准”。CK-MB 在急性心肌梗死发病后4 8h内增高，24h达峰值，两三天恢复正常。CK-MB因其具有重要的生理功能和临床应用价值已引起人们广泛的重视和深入的研究。传统上多用酶联免疫吸附法、化学发光法及胶体金免疫层析法等测定血清中的 CK-MB。但酶联免疫吸附法操作复杂，检测耗时长；化学发光法对技术要求高，不易在临床实验室中进行常规开展。胶体金免疫层析法虽然具有标本用量少，简便快速，便宜的优势，然而当遇到某些样本中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低。中国专利申请号CN200610114997. 9公布了一种血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法。该申请号专利主要利用肌酸激酶催化磷酸肌酸与二磷酸腺苷反应生成三磷酸腺苷和肌酸，再用甘油激酶催化三磷酸腺苷和甘油生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油被磷酸甘油氧化酶氧化并产生过氧化氢，再经过氧化物酶作用，过氧化氢使鲁米诺氧化而发光。中国专利申请号200520041211. 6披露了一种心血管疾病诊断和预测多指标蛋白芯片检测试剂盒，该试剂盒采用化学发光法(如辣根过氧化氢酶和鲁米诺)检测，并能同时检测C反应蛋白、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶等八种抗体。虽然化学发光法灵敏度较高，但重复性和稳定性均较差，且仪器复杂、昂贵，不能单人份检测，限制了他们的广泛应用。美国专利US60/576327和60/592202，及其在中国申请的专利200580025931. 6都对胶体金免疫层析检测进行了论述。但相比于荧光检测，吸光度检测具有灵敏度低、线性范围窄等缺陷。量子点(quantum dots, QDs)又称半导体纳米晶，通常是由II VI族或III V族元素组成的稳定的、尺寸介于1 20nm之间的纳米微晶体。其具有许多优良的光学特性(1)量子点的荧光发射光谱窄而对称，荧光发射波长可调，且覆盖范围可从紫外到近红外区。(2)量子点的吸收光谱宽且连续，可实现一元激发，多元发射，适合于多色标记。(3) 量子点具有较强的光学稳定性。Cdk/ZnS量子点的光稳定性是罗丹明6G的100倍以上。 (4)量子点摩尔吸光系数可以高达106L/(mol ^m)，且荧光量子产率高(50 80% )，因而可产生较强荧光信号。( 量子点斯托克斯位移较大，荧光寿命长(20 50ns)，使得信号可以显著区分于背景和其它荧光基团。量子点是一种理想的应用于超灵敏和多组分生物化学分析的荧光探针。将量子点与抗体结合可应用于荧光免疫分析和检测。针对现有CK-MB检测方法灵敏度低、检测范围窄和定量不准确等不足，量子点荧光定量检测方法利用量子点多波长激发、高强度荧光强度、发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好的荧光特性，可提供一种量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，对CK-MB进行定量检测。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题为针对现有技术中检测肌酸激酶同工酶灵敏度低、线性范围窄和仪器昂贵等缺点，提供了一种定量检测CK-MB的荧光免疫层析方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为一种定量检测肌酸激酶同工酶CK-MB的荧光免疫层析方法，包括以下步骤步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将肌酸激酶同工酶CK-MB的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为 550 1300nm ；步骤2)将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550 1300·，在层析膜上分别设有定量带和两条质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应CK-MB的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；步骤幻以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带荧光信号强度，进而实现CK-MB的定量检测。本专利技术提供的一种定量检测CK-MB的荧光免疫层析的方法，是一种以量子点为荧光信号的，采用双色标记技术，在免疫层析试纸条上实现CK-MB快速灵敏检测的方法。本专利技术定量检测CK-MB的荧光免疫层析方法能够解决现有荧光免疫层析技术中背景与信号难区分、灵敏度低、荧光定量方法不明确的不足和缺陷，可实现对微量样本的检测。由于量子点荧光受激发光干扰很小，灵敏度大大提高，其灵敏度是用传统染料和有色标记物检测方法的10 1000倍。本专利技术采用化学交联或生物分子间特异性作用将CK-MB的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，其中特异性抗体为对应CK-MB的一个或多个抗原表位的抗体。本专利技术中的化学交联为当量子点表面有活性基团，可与抗体或质控分子直接反应时，不需用化学交联剂，反之用化学交联剂把抗体修饰到量子点表面。在本专利技术的实施例中采用化学交联法对量子点进行蛋白质分子修饰的方法为利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛等交联剂将量子点表面的官能团(如羧基、氨基)与蛋白质分子(如抗原、抗体等)表面的官能团(如氨基、羧基、醛基等)连接。作为优选，在本专利技术的一个实施例中，采用EDC/NHS交联法对量子点进行修饰。其中EDC/NHS交联法对量子点进行蛋白质分子修饰的一般步骤为将量子点溶液与EDC和 NHS混合，然后加入一定量的蛋白质，以缓冲液为反应介质本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王东，
申请(专利权)人：深圳康美生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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