包含血凝素的嵌合流感病毒样颗粒制造技术

提供了在植物或植物部分中合成嵌合流感病毒样颗粒(virus-like?particle，VLP)的方法。该方法涉及在植物或植物部分中表达嵌合流感HA。本发明专利技术还涉及包含嵌合流感HA蛋白和植物脂质的VLP。本发明专利技术还涉及编码嵌合流感HA的核酸以及载体。VLP可用于配制流感疫苗，或者可用于加强现有的疫苗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请要求于2009年6月M日提交的美国临时申请No. 61/220，161的优先权。本专利技术涉及病毒样颗粒。更具体而言，本专利技术涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样颗粒和生产嵌合流感病毒样颗粒的方法。
技术介绍
流感是由呼吸道病毒引起的人死亡的首要原因，在流感季节，估计全世界10 20%的人口被感染，每年导致250 500,000的死亡。目前抗击人流感的方法是每年接种。疫苗通常是几种毒株的组合，这些毒株被预测为即将到来的流感季节的强势毒株(dominant strain)，但是每年生产的疫苗剂数量不足以接种全世界人口。例如，根据目前的产量加拿大和美国获得足以免疫其约三分之一人口的疫苗剂，而仅有17%的欧洲人口可接种疫苗——在世界范围的流感大流行到来时，该产量是不够的。即使在给定年份中所需的年产量可以某种方式实现，但强势毒株逐年变化， 因此在一年中的低需求时间大量储备是不实际的。经济、大规模地生产有效的流感疫苗是政府和私营企业等极为关注的。流感血凝素(HA)表面糖蛋白是受体结合蛋白也是膜融合蛋白。它是具有相同亚基的三聚体，每个亚基包含两条二硫键连接的多肽HAl和HA2，它们来自前体HAO的蛋白水解切割，HAO的N端有信号肽序列，HAO的C端有膜锚定序列。形成HAl和HA2的切割产生较小多肽HA2的N端，HA2的C端有膜锚定序列。切割对膜融合活性是必需的，但对免疫原性不是必需的。HA2的N端序列被称为“融合肽”，因为类似疏水序列的切割也是其他病毒融合蛋白所需要的，并且该序列20个残基的合成肽类似物在体外与膜融合。—般来说，球形“头部”的表面包含几个柔性环，其具有良好表征并且可变的抗原区域，称为位点 A、B、C、D 和 E(综述见 Wiley 等，1987. Annu Rev Biochem 56:365-394)。 已描述了在一些位点(例如B和E)插入或替换短肽序列以进行免疫研究(Garcia-MstW 等1995. Biologicals 23 :171-178)。大小从53至246个氨基酸的表皮生长因子(EGF)、 单链抗体(scFV)和IgG的Fc结构域已被插入到H7的N端，并且已成功表达嵌合体 (Hatziioannou 等，1999. Human Gene Therapy 10:1533-1544)。最近，炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis)保护性抗原的90和140个氨基酸的结构域已被融合到H3的氨基末端(Li 等，2005. J. Virol 79:10003-1002)。Copeland (Copeland 等，2005. J. Virol 79: 6459-6471)描述了在H3柄(stalk)上表达gpl20Env HIV表面糖蛋白，其中gpl20结构域替换了 HA的整个球状头部。已开发了几种重组产物作为候选重组流感疫苗。这些方法集中于甲型流感病毒 HA和NA蛋白的表达、生产和纯化，包括用杆状病毒感染的昆虫细胞(Crawford等，1999 Vaccine 17 :2265-74 Johansson, 1999 Vaccine 17 :2073-80)、病毒载体和 DNA 疫苗构建体(Olsen 等，1997 Vaccine 15 :1149-56)表达这些蛋白质。生产用于疫苗目的的非感染性流感病毒株是避免意外感染的一种方法。作为替代，已研究了用作培养病毒之替代物的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP) 0 VLP模拟病毒衣壳的结构，但缺少基因组，因此不能复制或提供用于再次感染的工具。目前流感病毒 VLP的生产技术依赖于多种病毒蛋白的共表达，这种依赖性是这些技术的缺点，因为在大流行和每年流行的情形中，响应时间对于接种来说是至关重要的。需要更简单的VLP生产系统(例如依赖于仅一种或几种病毒蛋白的表达而不需要表达非结构病毒蛋白)来加快疫苗的开发。包膜病毒可在从被感染细胞“出芽”时获得脂质包膜，并且从质膜或内部细胞器的膜获得膜。例如在哺乳动物细胞或杆状病毒细胞系统中，流感病毒从质膜出芽(Quan等 2007 J.Virol 81:3514-3524)。已知仅有几种包膜病毒感染植物(例如，番茄斑萎病毒 (Tospovirus)和弹状病毒(lihabdovirus)的成员)。已知的植物包膜病毒的特征在于从宿主细胞的内膜出芽，而不是从质膜出芽。虽然已在植物宿主中生产了少量重组VLP，但它们均不来源于质膜，这引出了如下问题，即是否可以在植物中生产质膜来源的VLP，包括流感病毒VLP0在任何系统中形成VLP都对蛋白质结构要求很高——改变对应于选定球状结构之表面环的短序列可能对多肽本身的表达没有太大影响，但是缺乏证明这些改变影响VLP形成的结构研究。HA多个区域的协调和结构(例如膜锚定序列，将球状头部与膜分隔开的三聚体柄或茎区域)随病毒而进化，并且可能不能进行类似的改变而不对HA三聚体完整性和 VLP的形成造成损失。在WO 2009/009876中，本专利技术人已描述了流感HAVLP的生产。
技术实现思路
本专利技术涉及病毒样颗粒。更具体而言，本专利技术涉及包含嵌合流感血凝素的病毒样颗粒和生产嵌合流感血凝素病毒样颗粒的方法。本专利技术的一个目的是提供改进的嵌合流感病毒样颗粒(VLP)。本专利技术提供了包含嵌合流感HA的多肽，该嵌合流感HA包含茎结构域簇(stem domain cluster, SDC)、头部结构域簇(head domain cluster, HDC)和跨膜结构域簇 (transmembrane domain cluster，TDC)，其中SDC 包含 F，1、F，2 和 F 亚结构域；HDC 包含 RB、El和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA。第一和第二流感HA可独立地选自H1、H3、H5和B。而且，多肽可以包含信号肽。本专利技术还提供了编码包含嵌合流感HA之多肽的核酸，该嵌合流感HA包含茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中SDC包含F，1、F，2和F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA。，核酸还可以编码除所述SDC、HDC和TDC外包含信号肽的多肽。还提供了在植物中生产嵌合流感病毒样颗粒(VLP)的方法，该方法包括a)向植物或其部分引入编码嵌合流感HA的核酸，该嵌合流感HA包含信号肽、茎结构域簇(SDC)、头部结构域簇(HDC)和跨膜结构域簇(TDC)，其中SDC包含F，1、F，2和 F亚结构域；HDC包含RB、E1和E2亚结构域；TDC包含TmD和Ctail亚结构域；并且其中至少一个亚结构域来自第一流感HA，其他亚结构域来自一种或更多种第二流感HA，和b)在允许核酸表达的条件下孵育植物或其部分，从而生产VLP。本专利技术包括上述方法，其中在引入步骤(步骤a)中，核酸以瞬时方式引入植物中。 或者，在引入步骤(步骤a)中，核酸被引入植物并且稳定整合。该方法还可包括步骤c)收获宿主并纯化VLP。本专利技术提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：马农·科图雷，米凯莱·达吉斯，皮埃尔奥列弗·拉瓦，路易斯菲利普·韦齐纳，马克安德烈·德奥斯特，
申请(专利权)人：麦迪卡格公司，
类型：发明
国别省市：