NK细胞的扩增制造技术

本发明专利技术提供在封闭的细胞培养系统中将NK细胞和NK样T细胞大规模扩增并同时激活的方法，其中该扩增的细胞表现为细胞毒性增强。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细胞培养和免疫疗法，特别是将NK细胞和NK样T细胞大规模扩增并同时激活以用于治疗。所述细胞在封闭的自动培养系统中扩增，例如使用生物反应器。
技术介绍
自从20世纪80年代发现淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞(Grimm EA.等人，1982 ； Rosenberg S.，1985)，对抗癌症的细胞免疫疗法被彻底地研究。进行实验最多的研究之一是自体或同种异体的细胞毒性效应物(cytotoxic effector)的过继性转移，该效应物具有肿瘤细胞杀灭潜能以触发移植物抗肿瘤 (graft-vs-tumor,GvT)效应。在多种具有潜在抗肿瘤效应的效应物群体中间，自然杀伤细胞(NK细胞)和NK样T细胞(NK-like T cells)以其高的细胞毒性能力而突出(Sutlu T and Alici Ε. ，2009)。NK细胞和NK样T细胞正常地仅以少数存在于外周血液单个核细胞(PBMCs)和效应细胞制品(pr印arations)(如LAK细胞)中。因此，使用从健康捐赠者(Carlens S.等人，2001 and US 10/242，788)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病患者(Guven H.等人，2003) 和多发性骨髓瘤(MM)患者(Alici E.等人，2008)得到的PBMCs，使多克隆NK细胞和NK样 T细胞在细胞培养瓶中扩增的涉及符合现代优良生产实践(cGMP)要素的方法得以开发。 在体外以及人类肿瘤实验模型(Guimaraes F.等人，2006)中，这些细胞对新鲜的人类肿瘤细胞显示特异性的细胞毒活性，这开启了其在临床环境下进行研究的可能性。然而，常规的基于瓶的培养费事而繁琐，因此限制了实际可处理细胞的数量。此前公开的方案(例如 Miller JS.等人，1994 ；Pierson BA.等人，1996 ；Luhrn J.等人，2002 ；Klingemann HG and Martinson, 2004)涉及效应细胞制品，也包括例如在培养前分离NK前体或⑶56以及使用饲养细胞(feeder cell)或不符合cGMP的要素的步骤。这些缺点使得此前的方案不是最适宜的，且不足以支持大型临床研究。另外，NK细胞在细胞培养瓶中的扩增，有暴露于外部试剂和污染物的内在风险。尽管所述风险在GMP实验环境中得以最小化，只要封闭自动系统提供充足数量的细胞，这种封闭自动系统的使用显然是优选的。由于造血细胞对剪切(shear)相对敏感，可合理地设想高剪切方法(high shear processes)不适于离体扩增(Nielsen，1999)。因此，依赖外部滤器和高流速的搅拌槽 (stirred-tank)生物反应器(Pierson.等人，1996)或灌注培养系统不太可能提供高效率。用基于NK细胞和NK样T细胞的免疫疗法治疗癌症，有很多有前景的方法。然而， 这些效应细胞在符合GMP的封闭系统下的离体(ex vivo)扩增和激活是促进临床频繁应用的关键因素。其他研究者对离体扩增和/或激活NK细胞也进行了尝试，并且使用纯化/静息的、短期或高度纯化的和长期激活的NK细胞的治疗方案也正在研究。这些研究报道，NK细胞输注耐受性好并且部分地有效。然而，用于效应细胞制品的方案通常包括附加的步骤，例如NK前体或CD56在培养前的分离以及饲养细胞和/或不符合cGMP的要素的使用。这些缺点使得上述方案不是最适宜的并且不足以支持大型临床研究。对于上述报道的彻底分析表明，对于优化的NK细胞的离体扩增的自动方法是需要的。常规的基于瓶的培养，其一个问题在于规模，也就是说细胞数量因繁琐的瓶处理而受到限制。此外，由于每次更换培养基或细胞分离时该系统暴露于环境中，因此感染的风险很高。其他需要解决的问题包括开发一种成本有效的、易操作的效应细胞扩增方法，且该方法包括良好限定的cGMP质量要素。优选地，该培养系统也无动物产品和饲养细胞。专利技术概述本专利技术涉及封闭系统，以大规模扩增并同时激活用作细胞治疗产品的自然杀伤 (NK)细胞和NK样T细胞。本专利技术特别公开了一种大规模扩增并同时激活表型为CD3_CD56+ 的NK细胞和表型为CD3+CD56+的NK样T细胞的方法，其中该扩增的细胞与使用常规方法 (例如在相同或近似条件下使用瓶)培养的细胞相比，表现为细胞毒性增强。本专利技术方法将进一步在说明书、非限制性实施例以及权利要求中公开。专利技术者们调研了使用封闭系统进行NK细胞大规模扩增的可行性。使用健康捐赠者和患有MM患者的PBMCs，通过与常规的细胞培养瓶比较，对两个不同的封闭系统(细胞培养袋和自动生物反应器)进行了评价，其目的是开发自动的符合GMP的方案，以大规模生产用于免疫疗法中的NK细胞。同时，专利技术者们在癌症患者中的I期临床试验中，成功地完成了同种异体环境 (allogeneic setting)的该细胞产品的安全性评价(Barkholt L.等人，2009)。根据本专利技术的第一个实施方案，提供了大规模扩增并同时激活一些细胞类型的方法，其中使用了封闭的细胞培养系统，且其中使用该方法所得的扩增的细胞经体外细胞毒性测试验证表现为细胞毒性增强。优选地，该细胞类型是表型为CD3—CD56+的NK细胞和/ 或表型为⑶3+⑶56+的NK样T细胞。根据优选的实施方案，该方法包括以下步骤将所述细胞加入所述封闭系统，该系统包括补充血清、白细胞介素-2 (IL-幻和抗CD3抗体的生长培养基；搅拌和加热下在所述系统中扩增所述细胞，直到扩增细胞群中至少35%含有激活的NK细胞和NK样T细胞，并且所述扩增的细胞经体外细胞毒性测试表现为细胞毒性增强。根据公开方法的一个具体实施方案，血清选自人血清和自体血清。培养基中补充有约50至约1500U/ml IL-2、约1至约50ng/ml抗CD3抗体和约1至约40%血清。根据另一具体实施方案，所述搅拌和加热在如下条件下进行温度约为36-40°C ； CO2浓度约为4. 7-5. 1% ；以一定速率和角度温和振摇，使细胞能够粘附于封闭细胞系统的表面。所述振摇在约4-8/分钟的振摇速率和约4-8°的振摇角度进行。所述扩增优选地进行至细胞总数扩增至少约10倍，或该扩增细胞群的至少约 50%分别含有激活的NK细胞和NK样T细胞。用于扩增所述细胞的细胞样品优选为外周血液、细胞系或细胞因子刺激的外周血液的样品。最优选地，该细胞样品为外周血液单个核细胞(PBMC’ s)的样品。根据本方法的一个具体实施方案，该细胞样品从健康受试者收集。根据另一具体实施方案，该细胞样品从携肿瘤的受试者收集，所述受试者优选地患有选自以下的肿瘤血液肿瘤和实体瘤。根据另一具体实施方案，所述细胞主要由表型为⑶3_CD56+的NK细胞组成。初始加入封闭细胞系统的细胞浓度优选为约0. 5xl06至约MlO6Ail生长培养基。在本专利技术的一个具体实施方案中，该方法还包括以下步骤每日加入一定体积的补充血清和IL-2的培养基(相当于总培养体积约50% )，并且每日从该封闭细胞系统丢弃约相同体积的生长培养基。其中所述步骤是在总细胞密度比初始细胞密度至少增长约50% 时进行。优选地，所述步骤是在总细胞密度比初始细胞密度至少增长约300%时进行，但其中总培养体积的约75%被交换了。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.03.26 US 61/163,5901.大规模扩增并同时激活表型为⑶3TD56+的自然杀伤(NK)细胞和表型为⑶3+⑶56+ 的NK样T细胞的方法，其中所述扩增和激活是在封闭系统中进行的，并且所得扩增的细胞经体外细胞毒性试验测定表现为细胞毒性增强。2.权利要求1的方法，其中所述方法包括以下步骤-将所述细胞加入所述封闭系统，该系统含有补充了血清、白细胞介素-2 (IL-幻和抗 CD3抗体的生长培养基；-搅拌和加热下在所述系统中扩增所述细胞，直到扩增的细胞群中至少35%含有激活的NK细胞和NK样T细胞，并且所述扩增的细胞经体外细胞毒性试验测定表现为细胞毒性增强。3.权利要求2的方法，其中所述搅拌和加热在如下条件下进行温度为约36至约40°C; CO2浓度为约4. 7至约5. 1% ；以一定速率和角度温和振摇，使细胞粘附于封闭细胞系统的表面。4.权利要求2的方法，其中所述振摇在约4-8/分钟的振摇速率进行。5.权利要求2的方法，其中所述振摇在约4-8°的振摇角度进行。6.权利要求2的方法，其中所述扩增进行至细胞总数扩增至少约10倍。7.权利要求2的方法，其中所述扩增进行至该扩增的细胞群的至少约50%分别含有激活的NK细胞和NK样T细胞。8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述细胞样品为外周血液、细胞系或细胞因子刺激的外周血液的样品。9.权利要求8的方法，其中所述细胞样品为外周血单个核细胞(PBMCs)样品。10.权利要求2的方法，其中初始加入封闭细胞系统的细胞浓度为约0.5xl06至约 2xl06/ml生长培养基。11.权利要求1-10中任一项的方法，其进一步包括每日加入相当于总培养体积约50% 的补充血清和IL-2的培养基，并且每日从该封闭细胞系统丢弃...

【专利技术属性】
技术研发人员：E阿里西，
申请(专利权)人：阿瓦里斯有限责任公司，
类型：发明
国别省市：