本发明专利技术涉及一种具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽及其应用。该基因为SEQID NO.1所示的氨基酸序列。该重组穿膜肽作为WNK丝苏氨酸激酶的特异性抑制剂，与WNK结合后，可使受WNK活化的NKCC1活性降低，从而特异性使脊髓背根神经节和三叉神经节神经元胞内Cl-减少，抑制GABA在背根神经节（DRG）中的兴奋性作用，抑制痛觉的传递。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有WNK (激酶域无赖氨酸的丝苏氨蛋白激酶)激酶抑制作用的重组穿膜肽及其应用。
技术介绍
疼痛(pain)是一种复杂的生理心理活动，是临床上最常见的症状之一。它包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感觉，以及机体对伤害性刺激的痛反应(躯体运动性反应和/或内脏植物性反应，常伴随有强烈的情绪色彩)。痛觉可作为机体受到伤害的一种警告，引起机体一系列防御性保护反应。但另一方面，疼痛作为报警也有其局限性(如癌症等出现疼痛时，已为时太晚)。而某些长期的剧烈疼痛，对机体已成为一种难以忍受的折磨。 因此，镇痛是医务工作者面临的重要任务。疼痛通常由导致组织损伤的伤害性刺激引起。刀割、棒击等机械性刺激，电流、 高温和强酸、强碱等物理化学因素均可成为伤害性刺激。组织细胞发炎或损伤时释入细胞外液中的钾离子、5-羟色胺、乙酰胆碱、缓激肽、组胺等生物活性物质亦可引起疼痛或痛觉过敏。全身皮肤和有关组织中分化程度最低的游离神经末梢，作为伤害性感受器，将各种能量形式的伤害性刺激转换成一定编码型式的神经冲动，沿着慢传导的直径较细的有髓鞘和最细的无髓鞘传入神经纤维，经背根神经节传到脊髓后角或三叉神经脊束核中的有关神经元，再经由对侧的腹外侧索传至较高级的疼痛中枢——丘脑、其他脑区以及大脑皮质，引起疼痛的感觉和反应。痛觉信息传递中，Y-氨基丁酸(GABA)在背根神经节(DRG)中是最重要的兴奋性递质。在发生神经病理性痛中DRG神经元细胞内i较高，神经元的翻转电位既高于静息电位，也高于动作电位产生阈值，因此当GABA作用于GABAa受体使通道开放时，Cl—流出神经元，使神经元膜发生去极化。Na+-K+-Cr共转运体1 (NKCCl)活性增强是导致DRG神经元内Cl_高的关键，因此抑制NKCCl的活性就成为开发新的镇痛药物的关键。而NKCCl的活性主要受其自身磷酸化的调节，WNK激酶可显著促进NKCCl的磷酸化使其活性大大提高，因本专利技术可显著抑制WNK激酶活性并因此抑制NKCCl的活性，故具有显著的镇痛效应。因本专利技术不像一些从天然毒素中提取的离子通道阻断剂那样直接作用于离子通道，因此副作用较小，镇痛作用较久。像N-型钙通道阻断剂芋螺毒素SNX-I I I镇痛效果虽然较好，但在高剂量时SNX-III会引起明显的运动障碍，并且这种副作用随剂量的增加而增强，具有很大的危险性。同样，目前美国已批准生产2种蛇神经毒素类药物一种是 Cobroxin，主治顽固性神经痛及恶性肿瘤痛；另一种是Ngloxin，主治关节痛。；其作用于中枢神经系统内的M型和N型Ach受体，产生镇痛作用，但也有极大的中毒死亡的危险。
技术实现思路
本专利技术目的之一在于提供一种具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽。本专利技术的目的之二在于提供该重组穿膜肽的制备方法。本专利技术的目的之三在于提供该重组穿膜肽在制备镇痛药物中的应用。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽，其特征在于该编码蛋白为SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。一种制备上述的具有WNK激酶抑制作用的基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为将含有HIVl (艾滋病毒)的Tat (转录反式激活因子)蛋白中最小的一段转位穿膜结构域序列，即 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Arg Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln序列，插入相应LING0-1 (具有 LRR结构和免疫球蛋白结构域的Nogo受体作用蛋白1)分子胞内域(氨基酸残基582 - 620)N-末端；再经体外大肠杆菌BL21系统表达并经纯化，即得到代号为TAT-LIC肽的具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽。上述的具有WNK激酶抑制作用的重组穿膜肽在制备镇痛药物中的应用。本专利技术提出药物组合物由具有活性成分的TAT-LIC肽和药学上可以接受的载体组成。其中活性成分的重量含量为0. 1-99. 9%。 该基因作为WNK丝苏氨酸激酶的特异性抑制剂，与WNK结合后，可使受WNK活化的 NKCCl活性降低，从而特异性使脊髓背根神经节和三叉神经节神经元胞外Cl—增多，抑制痛觉的传递。附图说明图1为TAT-LIC肽可做为特异性的WNK激酶的抑制剂，抑制WNK激酶的活性。图2为TAT-LIC肽可做为特异性的WNK激酶的抑制剂，抑制WNK激酶的活性，继而抑制了 NKCCl的磷酸化抑制NKCCl活性。具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。实施例1 制备TAT-LIC肽LIC肽(LING0-1，intracellular domain)对应人类 LING0-1 分子氨基酸序列 580-620， 来自以全长结构pEGFP-Nl-hLINGO-Ι为模板的亚克隆。融合蛋白TAT-LIC肽的产生是将含有HIVl的Tat蛋白中最小的一段转位结构域序列(MRGSHHHHHHGMARGYGRKKRRQRRRPQ)正确插入相应LIC cDNA的N-末端。融合蛋白经体外BL21系统表达并用镍亲和层析柱按经典方法纯化。实施例2 =SD大鼠脊髓背根神经节神经元的培养脊髓背根神经节的取材与培养将E16孕鼠乙醚麻醉后无菌取其胚胎，放入4 0CPBS 液中，在解剖显微镜下暴露SD胎鼠的椎管和椎间孔，用镊子将脊髓连带两旁的DRG —起取出放入PBS液中，用显微镜逐个摘除DRG，并尽量剥除神经节表面的筋膜，放入35mm培养皿中，眼科剪将神经节剪碎后移入2mL 0. 25 %TrypSin消化液的离心管中，在37 °〇的 C02培养箱中消化20min后，吸去消化液，直接加入含10 % FBS的DMEM培养基终止消化反应，离心后弃上清，用DMEM培养基重悬细胞，将其制成单细胞悬液，以IO5个/ mL的密度接种于用多聚赖氨酸包被处理的35mm培养皿中，于37 °C、5 % C02培养箱中培养 3小时后换NBl培养基(NBl培养基组分为Neurobasal培养基补充加入4. 5g / L D —葡萄糖，2mmol / L谷氨酰胺，1% FBS, 2% B27添加剂，IOug / L⑶NF)。每周换液2次。实施例3 =TAT-LIC肽处理原代培养的SD大鼠脊髓背根神经节神经元，可以显著抑制WNK激酶的磷酸化，即抑制WNK激酶的活性。(见图1)具体实验过程为在实施例2中取得的原代培养的SD大鼠脊髓背根神经节神经元， 用TAT-LIC肽(终浓度为IOOnM)或对照肽(终浓度为IOOnM)处理3小时。用PBS清洗两次加入 RIPAI 组织裂解液(20mM Tris-HCI, pH 7. 5,137mM NaCI,50mM NaF,0. 02%NaN3, l%NP-40,2mM EDTA,2mM benzamidine,ImM PMSF,2pg/ml pepstatin A,2pg/ml leupeptin, 4 pg/ml antipain，2pg/ml aprotinin, 2mM DTT)及磷酸酶抑制剂。细胞经手工冰上勻浆， 勻浆液于4°C 14, 000 rpm离心10 min，取上清。免疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓辉，张照环，黄海，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：
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