一种生产分离的蜘蛛丝蛋白的聚合物的方法，包括提供所述蜘蛛丝蛋白在液体介质中的溶液，所述液体介质具有6.4或更高的pH和/或防止所述蜘蛛丝蛋白聚合的离子组成。将液体介质的性质调节至6.3或更低的pH和允许蜘蛛丝蛋白聚合的离子组成。使蜘蛛丝蛋白在所述液体介质中形成聚合物，并从所述液体介质中分离出所得到的蜘蛛丝蛋白聚合物。所得到的聚合物可以用作纤维、薄膜、泡沫、网或网状物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质重组生产的领域，更具体地涉及蜘蛛丝蛋白(蛛丝蛋白 (spidroin))的重组生产。本专利技术提供了生产分离的蜘蛛丝蛋白的聚合物的方法。还提供了新的蜘蛛丝蛋白以及用于生产这种蛋白质及其聚合物的方法和多核酸分子。
技术介绍
蜘蛛丝是天然的高性能聚合物，由于强度和弹性的结合，获得非凡的韧性和延伸性。蜘蛛具有多至七种的不同腺体，其产生多种具有不同机械特性和功能的丝类型。由主壶腹腺(major ampul late gland)产生的拖丝(dragline silk)是韧性最大的纤维，并且以重量为基础时，其优于人造材料，如抗拉钢(tensile steel)。拖丝的所述特性在用于医疗或技术目的的新材料的研发中是具有吸引力的。拖丝由两种主要的多肽组成，通常称为主壶腹蛛丝蛋白(MaSp) 1和2，但在十字圆蛛(Araneus diadematus)中称为例如ADF-3和ADF-4。这些蛋白质具有200_720kDa范围内的分子量。编码黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)的拖丝蛋白的基因是唯一已经完全表征的基因，并且MaSpl和MaSp2基因分别编码31 和3779个氨基酸(Ayoub NA等，PloS ONE 2(6) :e514，2007)。Huemmerich，D.等，Curr.Biol.(当代生物学)14，2070-2074 Q004) 中讨论了拖丝多肽的性质。蜘蛛拖丝蛋白或MaSp具有三部分的组成非重复的N-端结构域、由许多重复的聚-Ala/Gly区段组成的中心重复区、和非重复的C-端结构域。通常认为重复区形成丝纤维中的分子间接触，而末端结构域的确切功能还不太清楚。还认为与纤维形成相关，重复区经历了从无规卷曲和α-螺旋构象至β-折叠结构的结构转变。蛛丝蛋白的C-端区在蜘蛛物种和丝类型之间通常是保守的。蜘蛛丝的N-端结构域是最保守的区域，但其功能尚未了解。Rising, A 等，Biomacromolecules (生物大分子)7，3120-31 (2006)表征了 Euprosthenops australis MaSpl基因的5，端，并且推导出相应的氨基酸序列。重组表达 MaSpl蛋白的N-端结构域。蜘蛛丝蛋白及其片段难以以可溶形式来重组产生。大部分之前的生产人造蜘蛛丝纤维的尝试包括在非生理溶剂中的增溶步骤。几种因素使得拖丝蛋白的表达变得复杂。由于基因的高重复性，以及伴随的蛋白质的受限的氨基酸组成，产生了转录和翻译错误。微生物表达系统中tRNA库的耗尽，和随后的不连续翻译，导致蛋白质合成的过早终止，可能是另一个原因。对蛋白合成切断讨论的其他原因是mRNA的二级结构形成和基因的重组。大于2.51Λ的天然MaSp基因已经显示出在细菌宿主中是不稳定的。此外，维持可溶形式的重组丝蛋白存在困难，因为两种天然衍生的拖丝片段和设计的嵌段共聚物，尤其是MaSpl/ ADF-4衍生的蛋白质，容易自我装配成无定形聚集物，引起蛋白质的沉淀和损耗。参见 Huemmerich, D.等，Biochemistry (生物化学)43，13604-13612 Q004)和 Lazaris，Α.等， Science (科学)295,472-476 (2002)。生产人造蜘蛛丝的尝试中已经使用了编码拖丝蛋白的天然或合成的基因片段。已经在包括细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物、昆虫细胞、转基因蚕和转基因山羊的各种系统中表达了重组拖丝蛋白。参见，例如，Lewis, R. V.等，Protein Expr. Purif.(蛋白表达和纯化)7，400-406(1996) ；Fahnestock, S. R. & Irwin, S. L. Appl. Microbiol. Biotechnol. (应用微生物学和生物技术)47,23-32 (1997) ；Arcidiacono, S.等，Appl. Microbiol. Biotechnol.(应用微生物学和生物技术)49，31-38 (1998) ；Fahnestock, S. R. & Bedzyk, L. A. Appl. Microbiol. Biotechnol.(应用微生物学和生物技术)47，33-39 (1997)；和 Lazaris, A.等，Science (科学)295,472-476 (2002)。Huemmerich, D.等，Biochemistry (生物化学)43，13604-13612 Q004)公开了一种合成基因，“ (AQ)12NR3”，编码重复的富含Ala和富含Gly/Gln的片段以及非重复片段，所有片段都源自来自园蛛属(Araneus)的ADF3。该基因表达成可溶性蛋白质，该蛋白质聚集，但没有形成聚合物或纤维。WO 03/057727公开了可溶性重组丝多肽在哺乳动物细胞系和动物中的表达。所获得的丝多肽在含水介质中呈现出低溶解性和/或形成沉淀物。由于所获得的丝多肽没有自发地聚合，需要纺织(spinning)来获得聚合物或纤维。所表达的丝多肽含有多个重复单位和源自蜘蛛丝蛋白羧基端区域的非重复单位。WO 07/078239 和 Stark, M 等，Biomacromolecules (生物大分子)8，1695-1701， (2007)，公开了由具有高含量的Ala和Gly的重复片段和蛋白质的C-端片段组成的微型蜘蛛丝蛋白，以及包含蜘蛛丝蛋白的可溶性融合蛋白。在蜘蛛丝蛋白从其融合配偶体中释放出来时，自发获得蜘蛛丝蛋白的纤维。小的融合单位对于纤维形成是足够的，并且是必需的。Hedhammer，M等，Biochemistry(生物化学)47，3407-3417，(2008)研究了热、pH和盐对重组N-和C-端蛛丝蛋白结构域和含有四个聚-Ala和富含Gly的嵌合块(co-block) 的重复蛛丝蛋白结构域的结构和聚集和/或聚合的影响。公开了 N-端结构域的二级和三级结构与PH无关，保持未改变，并且唯一检测到的由N-端结构域形成的稳定装配体是二聚体。相反，表明C-端结构域在蜘蛛丝蛋白的装配中具有主要作用。专利技术概述本专利技术的一个目的是提供一种生产蜘蛛丝蛋白的聚合物的方法，其中控制蜘蛛丝蛋白的溶解性和聚合。本专利技术的再一个目的是提供一种生产蜘蛛丝蛋白的纤维的方法，其中控制蜘蛛丝蛋白的溶解性和纤维形成。本专利技术的另一个目的是提供一种新的蜘蛛丝蛋白，其可以提供蜘蛛丝纤维、薄膜、 泡沫、网(net)和网状物(mesh)。本专利技术的一个目的是提供一种水溶性蜘蛛丝蛋白，其可以容易地处理，以在需要时聚合成纤维。该特性使得以后的所有步骤可以在生理条件下进行，这降低了毒性和蛋白质变性的风险。本专利技术的再一个目的是提供新的蜘蛛丝蛋白的纤维。本专利技术的一个目的是大规模地提供蜘蛛丝蛋白，其可以容易地处理，以在需要时聚合成纤维。本专利技术的再一个目的是提供生产蜘蛛丝蛋白和蜘蛛丝蛋白纤维的方法。为了从以下公开内容能清楚这些和其他目的，根据第一个方面，本专利技术提供了一种生产分离的蜘蛛丝蛋白的聚合物的方法，所述方法包括下述步骤(i)提供由170至760个氨基酸残基组成的蜘蛛丝蛋白，并且该蜘蛛丝蛋白包含由至少一个100至160个氨基酸残基的片段组成的N-端片段，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：扬·约翰松，麦·赫德哈马尔，安娜·里辛，谢斯廷·努德林，
申请(专利权)人：思百博技术股份公司，
类型：发明
国别省市：
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