新型乙酰辅酶A羧化酶制造技术

本发明专利技术提供新型乙酰辅酶A羧化酶。本发明专利技术的上述课题通过本发明专利技术的序列号1的碱基序列及序列号2的氨基酸序列来解决。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新型乙酰辅酶A羧化酶。
技术介绍
脂肪酸是构成磷脂质、三酰基甘油等脂质的重要成分，含有2个以上不饱和键的脂肪酸总称为高不饱和脂肪酸(PUFA)，已知有花生四烯酸、二高Y-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等，并已报道了各种生理活性(非专利文献1)。其中，花生四烯酸作为形成前列腺素、白三烯等的中间代谢物受到关注，已进行了大量的将其应用于功能性食品、医药品的原料的尝试。而且因为花生四烯酸在母乳中含有， 对婴儿的发育，特别是胎儿的身高、脑的发育很重要，所以作为婴儿发育的必要成分，从营养学的观点来看与DHA(二十二碳六烯酸)共同受到关注。虽然期待该高不饱和脂肪酸在各种领域中的应用，其中也包括了在动物体内不能合成的物质。因此，开发出了通过培养各种微生物来获得高不饱和脂肪酸的方法。并且，也进行了用植物生产高不饱和脂肪酸的尝试。在这种情况下，已知高不饱和脂肪酸例如作为三酰基甘油等储存脂质的构成成分，可在微生物的菌体内或植物种子中积累。在原核生物和真核生物中，虽然与新型脂肪酸合成、脂肪酸链延长相关的酶的分子结构不同，但酶反应的机理在任何类型的细胞中均相同。脂肪酸的生物合成以乙酰辅酶 A为起始物质，通过乙酰辅酶A羧化酶(E. C. 6. 4. 1. 2)的催化作用，由乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A。在脂肪酸合成酶(FAS)的作用下，经过乙酰辅酶A与丙二酰辅酶A的缩合 还原·脱水·再还原的一系列反应脱去(X)2进行结合从而使碳原子数每次延长2个，合成各种饱和脂肪酸。此外，在脂肪酸链延长反应中，也是经过酰基辅酶A与丙二酰辅酶A的缩合·还原·脱水·再还原的一系列反应脱去CO2进行结合从而使碳原子数每次延长2个。乙酰辅酶A羧化酶(以后有时记为“ACC”)，到目前为止曾在几种生物中报道过。 哺乳类的ACC是典型的变构酶，具有被柠檬酸变构激活、受长链脂肪酰CoA酯的抑制、磷酸化而失活的性质。在菌类中，已对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ACC进行了充分的研究。酿酒酵母(S. cerevisiae)的ACC定位于细胞质和线粒体内，被各种ACCl及HFAl 基因编码。已知ACCl基因是必须基因，缺失后即会致死(非专利文献2)。由突变株的分析可知，ACCl基因与从核内运输加poly(A)的mRNA等有关(非专利文献3)。曾进行了在植物中使用ACC基因从而使种子中的油脂增加的试验(非专利文献 4)。例如已报道使拟南芥的ACC在菜籽中表达时，重组体的种子中每单位干燥重量的脂肪酸量增加，进而脂肪酸的组成也发生变化(非专利文献幻。但是，根据宿主生物本来具有的脂肪酸组成，而且根据导入的ACC基因的不同，脂肪酸组成如何发生变化也不同。另一方面，ACC的活性不仅在表达水平，而且在蛋白质水平上也受到各种调节(非专利文献3及 4)，在一系列的脂肪酸合成体系中与发挥作用的其他酶蛋白质的相互作用也成为问题。因此认为，为了获得所期望的脂肪酸组合物，需要与作为基因导入的宿主的生物相应的适当的ACC基因。对于作为脂质生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)(以下有时记为 "M. alpina")的ACC基因，已公知来自CBS528. 72株的作为ACC同源物认为具有ACC活性的基因的部分序列(非专利文献6)。但是还未确认含有该序列的蛋白质具有ACC活性。此外，对于在Malpina CBS696. 70株中油脂的蓄积和乙酰辅酶A羧化酶活性进行了分析(非专利文献7)。现有技术文献非专利文献非专利文献1 Lipids, 39,1147(2004)非专利文献2 Giaever G, et al. Nature 418，387-91 (2002)3 0. Tehlivets et al. , Biochimica et Biophysica Acta, 1771, 255-270(2007)非专利文献4 Biosci. Biotechnol. Biochem.，68(6)，1175-1184，(2004)非专利文献5 Plant Physiol. 113,75-81 (1997)非专利文献6国际碱基序列数据库注册号AJ586915非专利文献7 Microbiology, 145,1911-1917 (1999)
技术实现思路
但是，认为到目前为止所报道的ACC基因在导入宿主细胞内进行表达时对于脂质代谢的影响并不充分。而且还存在由于宿主不同，对油脂、脂肪酸的蓄积量的增减效果不能充分发挥的课题。因此，需要鉴定出在导入宿主细胞内进行表达时可对宿主的脂质代谢产生影响的新型蛋白质。并且需要鉴定出可生产利用价值高的脂肪酸含量高的油脂的蛋白质。本专利技术的目的是提供通过在宿主细胞内表达，或者对宿主的脂质代谢产生影响， 或者可增加目标脂肪酸的含量，从而可生产有用的油脂的蛋白质及核酸。本专利技术者为了解决上述课题进行了精心研究，首先进行脂质生产菌Malpina的 EST分析，从中提取出与已知ACC基因同一性高的序列。进而为了获得编码ACC的开放阅读框(ORF)的全长，进行cDNA文库筛选或通过PCR克隆全长cDNA。专利技术者将其导入酵母等具有高增殖能力的宿主细胞内以尝试产生脂肪酸组合物，成功克隆出与新型ACC相关的基因，该新型ACC可生成与以往ACC表达的宿主所产生的脂肪酸组合物相比不同的脂肪酸组合物，于是完成了本专利技术。即本专利技术如下所述。(1) 一种核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中任一项所述的核酸，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有80%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有 80%以上同一性的氨基酸序列组成、且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(e)核酸，其含有如下碱基序列，即与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有乙酰辅酶 A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列。(2)根据⑴所述的核酸，其特征在于，为以下(a) (e)中的任一项，(a)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由在序列号2所示的氨基酸序列中1 200个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成、且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(b)核酸，其含有如下碱基序列，即与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2XSSC、50°C的条件下杂交，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(c)核酸，其含有如下碱基序列，即由与序列号1所组成的碱基序列有90%以上同一性的碱基序列组成，且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的碱基序列；(d)核酸，其含有如下碱基序列，即编码由与序列号2所组成的氨基酸序列有 90%以上同一性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：落合美佐，樱谷英治，清水昌，小川顺，
申请(专利权)人：三得利控股株式会社，
类型：发明
国别省市：