本发明专利技术涉及利用酶比色法及酶联法技术的氨(氨离子)含量的测定方法、试剂的组成及成分，其测定的技术原理是依据氨激酶、丙酰辅酶A羧化酶、6-甲基水杨酸合成酶的系列催化反应完成，本发明专利技术还涉及一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒。本发明专利技术的测定方法灵敏度高、误差小，因此本发明专利技术的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于临床医学/食品检验。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学/食品检验测定
，更具体地，本专利技术涉及氨(氨离子)诊断/测定方法及其试剂盒。
技术介绍
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。扩散法是标本碱化后，释放出NH3,用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8% 13% ’离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的pH发生变化进行测定，该方法的CV为 3. 5% 4. 8%，回收率高。结合具体实际，应以酶法测定为实用。检索中国专利，仅查出87105593. 7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种氨(氨离子)的测定方法。本专利技术的另一个目的是提供一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒。本专利技术是通过下述技术方案实现的。本专利技术的方法是一种采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶 (偶)联法(Couple Reaction)的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在 340nm波长处的吸光度变化测定氨(氨离子)的方法。本专利技术氨(氨离子)测定方法的的技术原理是根据下述氨激酶、丙酰辅酶A羧化酶、6-甲基水杨酸合成酶的系列催化反应完成氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷酰胺腺苷二磷酸+磷酸根+甲基苹果酰-辅酶A丙酰辅酶A羧化酶腺苷三磷酸+丙酰-辅酶A+ 二氧化碳3 二氧化碳+6-水杨酸甲酯+4辅酶A+辅酶6-甲基水杨酸合成酶乙酰-辅酶A+3苹果酰-辅酶A+还原型辅酶本专利技术的方法利用氨激酶(ammonia kinase ；EC 2. 7. 3. 8)酶(偶)联丙酰辅酶 A 羧化酶(propionyl-CoA carboxylase ；EC 6. 4. 1. 3)、6-甲基水杨酸合成酶 (6-methylsalicylic acid synthase ；EC 2.3.1.165)酶促反应比色终点法。氨激酶酶解氨反应产生腺苷二磷酸，再通过(偶)联合丙酰辅酶A羧化酶、6-甲基水杨酸合成酶的作用，最终将辅酶(在MOnm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)， 从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，这样可以通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算氨(氨离子)的浓度大小。本专利技术是通过下述技术方案实现的。本专利技术涉及一种氨(氨离子)的测定方法。该氨(氨离子)测定方法的步骤如下A、样品准备A. 1标准样品的制备将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中，再将氨浓度调整到100微摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；A. 2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；A. 3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其氨(氨离子)浓度为0微摩尔/升；B、试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、辅酶、氨激酶、丙酰辅酶A羧化酶、6-甲基水杨酸合成酶、腺苷三磷酸、甲基苹果酰辅酶A、6-水杨酸甲酯、辅酶A与单价磷酸盐，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、 0. 001-7mol/L、0. l_2mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、I-IOOmmol/ L、l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 与 l-lOOmmol/L ；C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)空白样品的吸光度随时间的变化；F、数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到氨的含量ΔΑ (样品)-ΔΑ(空白)氨(氨离子)含量=-χ标准浓度(μπιοΙ/L)ΔΑ (标准)-ΔΑ(空白)式中Δ A(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化；Δ A(空白)表示步骤Ε)得到的空白样品的吸光度变化；Δ A (标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化。根据本专利技术，在所述的氨(氨离子)测定方法中，所述的缓冲液应该理解是能够使其测定介质的PH基本保持稳定(一般是6. 0-9.0)的溶液。如果该ρΗ高于9.0或ρΗ低6于6. 0，则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果，因此需要添加更多的介质与酶，才有可能达到预期的活性效果。在本专利技术中，所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或 “PBS”缓冲液的缓冲液。优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液。更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液。根据本专利技术，在所述的氨(氨离子)测定方法中，所述的稳定剂应该理解是一种能保护试剂中的介质(底物)与酶，使其不会随着时间推移而改变其性质，进而失去活性的物质，它会使得试剂具备很长的活性寿命，通常长达数月，甚至一、二年。如果没有所述的稳定剂，则试剂的活性在溶液中只能维持数十小时，顶多数天，就会逐渐失去活性而不再具备检测性能。在本专利技术中，所述的稳定剂使用量是0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够，则试剂活性的寿命就会缩短；如果所述的稳定剂使用量过高，则会增加成本。在本专利技术中，所述的稳定剂是一种或多种选自氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自氯化钠、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油或双乙酸钠的稳定剂。在本专利技术中，所述的辅酶是一种或多种选自NADP+、NAD+或thio-NAD+的辅酶。根据一种本专利技术的优选实施方式，本专利技术使用全自动生化分析仪测定氨(氨离子)时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下(参数)自动取样，然后在下述条件下进行测定测定方法为二点终点法/终点法，温度37°C，反应时间10 分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨(氨离子)样品与试剂的体积比例为 1/10-1/500，反应方向为正反应，延迟时间1/0分钟，检测时间4/5分钟。根据另一种本专利技术的优选实施方式，本专利技术使用的试剂溶液配制成如下双剂试剂由所述的缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸、甲基苹果酰辅酶A、6_水杨酸甲酯、 辅酶A与单价磷酸盐组成的试剂1 ；由所述的缓冲液、稳定剂、氨激酶、丙酰辅酶A羧本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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