用于检测基孔肯雅和登革热的基因序列制造技术

本发明专利技术人公开了一种检测生物样本中的基孔肯雅和登革热核酸的方法，所述方法包括步骤：（ａ）扩增步骤，其中在核酸扩增反应中通过基孔肯雅引物和登革热核酸引物对基孔肯雅和登革热核酸进行扩增；和（ｂ）检测步骤，其中将（ａ）中的扩增核酸在核酸杂交反应中与基孔肯雅核酸探针和登革热核酸探针杂交。还公开了能检测基孔肯雅和登革热的引物和探针序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。更具体而言，本专利技术涉及适合用于检测样本中病原体或其产物的核酸序列的方法。
技术介绍
登革热(dengue，DEN)是大部分热带和亚热带地区的流行病，基孔肯雅 (chikungunya,CHIK)热已经出现在大部分印度洋岛屿、印度、意大利，并且最近出现在马来西亚和新加坡。大量的分子测定法已经被记载，用于分别检测DENV和CHIKV。最近已报道了一种用于鉴别诊断DEN和CHIK的测定法(Dash et al.，2008)。虽然这种测定法可以同时检测这两种感染，但是该检测是通过常规的溴化乙啶染色的电泳胶方法进行的。相应地，这种方法不能区分真实检测结果和非特异性检测结果。本专利技术旨在解决现有技术中的这些问题和其他问题。
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面，本专利技术人提供一种检测生物样本中的基孔肯雅和登革热核酸的方法，该方法包括步骤(a)扩增步骤，其中在核酸扩增反应中通过基孔肯雅引物和登革热引物对基孔肯雅和登革热核酸进行扩增；(b)检测步骤，其中(a)中的扩增核酸在核酸杂交反应中与基孔肯雅核酸探针和登革热核酸探针杂交。所述扩增的核酸可以和多个登革热核酸探针杂交。所述登革热核酸探针可以能够与不同种登革热核酸结合。所述不同的登革热核酸的每一种均可以表征一种登革热株系。 该方法使得可以鉴定生物样本中来自具体登革热株系的核酸。所述核酸扩增反应可以包括聚合酶链式反应(PCR)。所述聚合酶链式反应可以包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。它可以包括二重RT-PCR。所述基孔肯雅和登革热探针可以是固定的。它们可以固定在微球上。所述微球可以包括编码的微球。这样可以使得对微球的鉴定显示出固定在其上的探针类型。所述编码的微球可以包括颜色编码的微球。所述扩增的核酸可以被可检测标记物标记。该方法可以包括，用可检测标记物标记基孔肯雅核酸引物和登革热核酸引物。该方法可以使得扩增步骤(a)产生经标记的扩增核酸。所述可检测标记物可以包括任何其存在是可显现的物质。可检测标记物可以包括为信号产生方式。所述信号产生方式可以包括生物素。它可以包括生物素链霉亲和素-藻红蛋白(biotin streptavidin-phycoerythrin)缀合物。所述方法可以包括，通过检测可检测标记物以检测扩增的核酸。所检测的扩增核酸可以结合在微球上。所述核酸可以通过微球固定的基孔肯雅探针和登革热探针结合到微球上。所述方法还可以包括鉴定微球以鉴定固定其上的探针。本方法使得能够鉴定结合的扩增核酸的类型。包括生物素链霉亲和素-藻红蛋白缀合物的可检测标记物可以借助第一激光检测。颜色编码的微球的类型可以借助第二激光确定。所述第一激光可以与所述第二激光有不同的波长。可检测标记物的检测与颜色编码微球的鉴定可以同时进行，或者不同时进行。可检测标记物的检测可以与颜色编码微球的鉴定类型可同步进行。基孔肯雅核酸引物可以由表Dl. 1中所示的核酸序列组成。登革热核酸引物可以由表Dl. 2中所示的核酸序列组成，或者以上两种情况同时出现。基孔肯雅核酸探针可以由表D2. 1中所示的核酸序列组成。登革热核酸探针可以由表D2. 2中所示的核酸序列组成。根据本专利技术的第2方面，本专利技术提供了一种根据本专利技术第1方面的方法，所述方法用于同步检测生物样本中基孔肯雅的存在情况和确定登革热株系。根据本专利技术的第3方面，本专利技术人提供了表Dl. 1、表D1.2、表D2. 1或表D2.2中所示的核酸序列，或者其变体、同系物、衍生物或片段。根据本专利技术的第4方面，本专利技术提供了根据本专利技术前述方面的两条或多条序列的结合物。所述结合物可以包含表Dl. 1和表Dl. 2中列出的两条或多条序列，或者表D2. 1和表D2. 2中列出的两条或多条序列，或者以上两种情况同时出现。该结合物可以由表Dl. 1和表Dl. 2中所示的每一种核酸序列，或者其变体、同系物、衍生物或片段组成。该结合物可以由表D2. 1和表D2. 2中所示的每一种核酸序列，或者其变体、同系物、衍生物或片段组成。该结合物可以由以上每一种结合物的组成的结合物来组成。所述核酸或结合物可以包括经标记的核酸。所述标记物可以包括生物素。它可以包括生物素链霉亲和素-藻红蛋白缀合物。所述核酸或结合物可以在溶液中。它可以包含固定的核酸。所述核酸可以固定在微球上。它可以固定在阵列上。所述阵列可以包括微阵列。根据本专利技术的第5方面，本专利技术人提供了由以下核酸序列组成的结合物表Dl. 1 和表Dl. 2中所示的每一种核酸序列或其变体、同系物、衍生物或片段；和(b)表D2. 1和表 D2. 2中所示的每一种核酸序列或其变体、同系物、衍生物或片段；其中(a)的核酸是在溶液中并且(b)的核酸固定在微球上。在第6方面中，本专利技术提供了一种用于检测患者中基孔肯雅症或登革热的试剂盒，所述试剂盒包括上文列出的核酸或结合物，以及使用说明书。在本专利技术的第7方面中，本专利技术提供了上文列出的核酸序列或结合物，作为基孔肯雅或登革热基因的核酸扩增引物的用途，或者作为基孔肯雅或登革热基因的核酸杂交探针的用途。根据本专利技术的第8方面，本专利技术人提供了一种诊断个体中基孔肯雅症或登革热的方法，所述方法包括从所述个体中获得生物样本并且通过上文列出的方法检测其中的基孔肯雅或登革热核酸。根据本专利技术的第9方面，本专利技术人提供了一种治疗或预防个体中基孔肯雅症或登革热的方法，所述方法包括根据本专利技术第8方面检测个体中的基孔肯雅症或登革热，并且对所述个体给予合适的治疗和预防。除非另外声明，本专利技术的实施将采用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域普通技术人员的能力范围内。参见例如 J. Sambrook, E. F. Fritsch, and Τ. Maniatis，1989，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Second Edition，Books 1—3，Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Ausubel， F. Μ.et al. (1995 and periodic supplements ；Current Protocols in Molecular Biology, ch.9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N. Y.) ；B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn,1996, DNA Isolation and Sequencing :Essential Techniques，John Wiley & Sons ；J. M. Polak and James 0' D. McGee，1990，In Situ Hybridization-Principles and Practice ；Oxford University Press ；M. J. Gait (Editor)，1984，Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach，Irl Press ；D.Μ. J. Lilley and J. E.Dahlberg,1992, Method本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种检测生物样本中的基孔肯雅和登革热核酸的方法，所述方法包括步骤：（ａ）扩增步骤，其中在核酸扩增反应中通过基孔肯雅引物和登革热引物对基孔肯雅和登革热核酸进行扩增，所述核酸扩增反应包括例如聚合酶链式反应（ＰＣＲ）如逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）或二重ＲＴ－ＰＣＲ；和（ｂ）检测步骤，其中（ａ）中的扩增核酸在核酸杂交反应中与基孔肯雅核酸探针和登革热核酸探针杂交，优选其中所述扩增核酸和能够与不同登革热核酸结合的多个登革热核酸探针杂交，所述不同登革热核酸的每一种均表征一个登革热株系，以能够鉴定生物样本中具体登革热株系的核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：井上雅文，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：SG