大范围核酸酶重组系统技术方案

本发明专利技术涉及一组基因构建体，其通过采用大范围核酸酶在基因组的特定位置产生双链断裂并因而刺激所述基因组位点与转染供体序列之间在该基因座的同源重组事件，从而在基因组的固定位置高效地并可重复性地引入特定的核苷酸序列。本发明专利技术还涉及使用这些构建体的方法和试剂盒形式的这些材料。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】大范围核酸酶重组系统本专利技术涉及一组基因构建体，其使得可以在基因组的固定位置高效地并可重复性地引入特定的核苷酸序列。本专利技术还涉及使用这些构建体的方法和试剂盒形式的这些材料。自从25年多以前在酵母中首次进行基因靶向实验以来(1，2)，同源重组已被用来插入、替换或删除多种细胞中的基因组序列(3-5)。然而，在哺乳动物细胞中靶向事件的发生频率非常低。同源重组的频率可通过所靶向基因座中特异性DNA双链断裂 (doule-strand break, DSB)而显著提高阳，7)。可采用大范围核酸酶(Meganuclease)产生这种DSB，所述大范围核酸酶是识别大的DNA靶向位点(>12bp)的序列特异核酸内切酶。这些蛋白质可切割独特的染色体序列而不影响基因组的整体完整性。天然的大范围核酸酶主要由归巢核酸内切酶(homing endonuclease)所代表，所谓归巢核酸内切酶是在真核动物、细菌和古细菌中发现的广泛存在的蛋白质类别(8)。对HceI和HO归巢核酸内切酶的早期研究已表明这些蛋白质的切割活性如何在活细胞中引发同源重组(homologous recombination, HR)事件，并证实染色体DSB的重组产生特性(9，10)。从那时起，已经在细菌(11)、哺乳动物细胞(6，7，12-14)、小鼠(15)和植物(16，17)中成功地将大范围核酸酶诱导的重组用于基因组工程目的。基因插入可例如用于将目的基因引入特定基因座，以用于产生异源蛋白质。目前的重组治疗蛋白质大部分在稳定转染目的基因的哺乳动物细胞(如CH0、小鼠SP2/0和NSO 细胞或人PerC. 6细胞系)中产生(18)。在筛选高表达克隆的过程中，蛋白质表达的水平和稳定性是两个主要的标准。对于改善筛选工作来说，在各克隆之间获得可重复性的结果是有利的。这些原则也适用于产生用于筛选特定药物靶标的细胞。同样的原则也可适用于在相同基因组背景下表达的多种基因，以在所得细胞系之间进行比较性研究和分析。这样的细胞系还可在筛选程序中被化合物文库作用。然而，目前没有在异源序列插入/缺失可容易进行确定的基因座处引发DSB的方法。本专利技术人开发了一组新的基因构建体，其使得在其它相同遗传背景的细胞系中可重复性地整合和表达目的基因(gene of interest, G0I)或一系列基因。根据本专利技术的第一方面，提供了一组基因构建体，其包括a)构建体(i)，其由至少包含以下组分的核酸分子编码A1-A2-A3-A4-A5 ⑴其中Al是第一启动子；A2是第一同源部分；A3是大范围核酸酶切割位点；A4是第一标记基因；A5是第二同源部分；并且其中构建体(i)被设置成稳定整合进至少一个靶细胞的基因组中；b)构建体(ii)，其由至少包含以下组分的核酸分子编码A2，-B1-B2-B3-B4-A5，(ii)其中A2’包含所述第一同源部分A2的一部分；Bl为与所述第一标记基因不同的第二标记基因；B2是第二启动子；B3是多克隆位点；B4是第三启动子；A5’包含所述第二同源部分A5的一部分；c)至少一种构建体，其选自包含以下的组构建体(iii)或(iv)，其由至少包含以下组分的核酸分子编码Cl-C2(iii)；C3(iv)；或构建体(ν)，其为至少包含以下组分的分离或重组蛋白质C4 (ν)；其中Cl是第四启动子；C2是大范围核酸酶的开放阅读框(ORF) ；C3是所述大范围核酸酶的信使RNA(mRNA)形式；C4是所述大范围核酸酶的分离或重组蛋白质；其中来自构建体(iii)、(iv)或(ν)的所述大范围核酸酶识别并切割A3 ；并且其中构建体(iii)、(iv) 或(ν)被设置成与构建体(ii)共转染进所述至少一个靶细胞中。该基因构建体系统使得可以在经改造的细胞中的特定基因组位置整合和表达 G0L·通过大范围核酸酶诱导的重组将包含可被克隆入B3部分的GOI的构建体(ii)在对应于构建体(i)之基因组整合位置的特定位点整合入基因组。所述整合事件以极高频率发生并非常特异。每个基因构建体由以上必需组分(Al至A5、A2’和A5’、B1至B4以及Cl至C2)组成，但在这些之间可存在其它核苷酸序列，前提是它们不影响本文定义的所请求保护之组分的特性。在本专利技术中，启动子是这样的核苷酸序列，当将其与编码开放阅读框的第二核苷酸序列组合放置时引起所述开放阅读框的转录。此外，在RNA分子的情况下，启动子也可以指这样的非编码序列，其作用是提高所述RNA分子的翻译水平。在本专利技术中，同源部分是指与另一核苷酸序列具有共有的核苷酸残基从而引导这些序列之间发生同源重组的核苷酸序列，更特别地具有至少95%的同一性，优选地97%的同一性，并且更优选地99%的同一性。构建体(i)的第一和第二同源部分以及构建体(ii) 的第一和第二同源部分可为100 %相同，或如所指出的较低同一性。特别地，构建体(i)的A2和A5部分以及构建体(ii)的A2’和A5’部分之间的重叠为至少200bp，并且不多于6000bp。优选地，所述重叠在IOOObp至2000bp之间。因此特别地，构建体(ii)的组分A2’和A5’分别包含构建体⑴之组分A2和A5 的至少200bp并且不多于6000bp。最特别地，构建体(ii)的组分A2’和A5’分别包含构建体⑴之组分A2和A5的至少IOOObp并且不多于2000bp。本领域已知发生有效水平的同源重组所需的重叠的量(49)，从这些已知的水平出发，本专利技术人鉴定出用于本专利技术构建体组的最有效重叠范围。在本专利技术中，大范围核酸酶切割位点旨在表示22至Mbp的双链回文、部分回文 (假回文)或非回文多核苷酸序列，其被LAGLIDADG归巢核酸内切酶识别并切割。这些术语是指大范围核酸酶诱导双链断裂(切割)的独特的DNA位置(优选地为基因组位置)。所述大范围核酸酶切割位点可以为由野生型大范围核酸酶(如I-CreI或I-DmoI) 识别并切割的DNA序列。或者所述大范围核酸酶切割位点可以为由识别并切割不同DNA靶标序列的经改变之大范围核酸酶识别并切割的DNA序列。本专利技术人和其他人已经证明可改造大范围核酸酶以识别不同的DNA靶标。尤其已经详细研究了 I-CreI酶，并且不同研究组已经采用半理性方法局部改变I-CreI的特异性 (26-28)。此外，通过将半理性方法和高通量筛选组合已改造出上百个具有局部改变之特异性的I-CreI衍生物-将I-CreI的Q44、R68和R70或者Q44、R68、D75和177残基突变并通过筛选鉴定出针对DNA靶标士 3 5位(5NNN DNA靶标)具有改变之特异性的一组变体、2 ，28)。-将I-CreI 的 Κ28、Ν30 和 Q38 或者 Ν30、Υ33 和 Q38 或 Κ28、Υ33、Q38 和 S40 残基突变并通过筛选鉴定出针对DNA靶标士8 10位(10ΝΝΝ DNA靶标)具有改变之特异性的一组变体(29, 30) ο所有这些大范围核酸酶变体和它们识别并切割的DNA靶标变体均包括在本专利申请中，并且可将特定大范围核酸酶及其靶标的任何组合用作构建体(i)的特征A3代表的大范围核酸酶靶标序列以及由构建体(iii)、(iv)和(ν)以不同形式编码的大范围核酸酶。在本专利技术中，标记基因是这样的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一组基因构建体，其包括：ａ）构建体（ｉ），其由至少包含以下组分的核酸分子编码：Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５（ｉ）其中Ａ１是第一启动子；Ａ２是第一同源部分；Ａ３是大范围核酸酶切割位点；Ａ４是第一标记基因；Ａ５是第二同源部分；并且其中构建体（ｉ）被设置成稳定整合进至少一个靶细胞的基因组中；ｂ）构建体（ｉｉ），其由至少包含以下组分的核酸分子编码：Ａ２’－Ｂ１－Ｂ２－Ｂ３－Ｂ４－Ａ５’（ｉｉ）其中Ａ２’包含所述第一同源部分Ａ２的一部分；Ｂ１为与所述第一标记基因不同的第二标记基因；Ｂ２是第二启动子；Ｂ３是多克隆位点；Ｂ４是第三启动子；Ａ５’包含所述第二同源部分Ａ５的一部分；ｃ）至少一种构建体，其选自包含以下的组：构建体（ｉｉｉ）或（ｉｖ），其由至少包含以下组分的核酸分子编码：Ｃ１－Ｃ２（ｉｉｉ）；Ｃ３（ｉｖ）；或构建体（ｖ），其为至少包含以下组分的分离或重组蛋白质：Ｃ４（ｖ）；其中Ｃ１是第四启动子；Ｃ２是大范围核酸酶的开放阅读框（ＯＲＦ）；Ｃ３是所述大范围核酸酶的信使ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）形式；Ｃ４是所述大范围核酸酶的分离或重组蛋白质；其中来自构建体（ｉｉｉ）、（ｉｖ）或（ｖ）的所述大范围核酸酶识别并切割Ａ３；并且其中构建体（ｉｉｉ）、（ｉｖ）或（ｖ）被设置成与构建体（ｉｉ）共转染进所述至少一个靶细胞中。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：让皮埃尔·卡巴尼奥尔，
申请(专利权)人：赛莱克蒂斯公司，
类型：发明
国别省市：FR