【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】切割来自谷氨酰胺合成酶基因的DNA靶序列的大范围核酸酶变体及其用途本专利技术涉及切割来自谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase, GS)基因的 DNA靶序列的大范围核酸酶(meganuclease)变体，编码所述变体的载体，经所述载体修饰的细胞、动物或植物以及所述大范围核酸酶变体及衍生产物用于基因组工程(genome engineering)以及体内和离体基因组疗法(基因细胞疗法)的用途。谷氨酰胺合成酶(GS)也称为谷氨酸-氨连接酶(glutamate-ammonia ligase， GLUL)，是一种负责从谷氨酸和氨进行谷氨酰胺生物合成的遍在管家酶，其使用ATP水解成 ADP和磷酸来驱动反应。因此，其是三羧酸循环和氨基酸代谢之间的重要连接(Meister et al.，1980，Glutamine metabolism，enzymology and regulation，Academic Press，N. Y.， p. 1-40 and 319-329).该酶促反应是哺乳动物细胞中谷氨酰胺形成的通路。培养基中不存在谷氨酰胺时，GS酶在培养哺乳动物...
【技术保护点】
１．Ｉ－ＣｒｅＩ变体，其特征为两个Ｉ－ＣｒｅＩ单体中的至少一个具有至少两个替换，其中ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ核心结构域的两个功能性亚结构域中各有一个，所述亚结构域分别位于Ｉ－ＣｒｅＩ的２８到４０位和４４到７７位，所述变体能够切割来自谷氨酰胺合成酶基因的ＤＮＡ靶序列，并可通过至少包括下述步骤的方法获得：（ａ）构建第一系列Ｉ－ＣｒｅＩ变体，其在ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ核心结构域的第一功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第一功能性亚结构域位于Ｉ－ＣｒｅＩ的２８到４０位，（ｂ）构建第二系列Ｉ－ＣｒｅＩ变体，其在ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ核心结构域的第二功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第二功能性...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1. I-CreI变体，其特征为两个I-CreI单体中的至少一个具有至少两个替换，其中 LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域中各有一个，所述亚结构域分别位于I-CreI 的观到40位和44到77位，所述变体能够切割来自谷氨酰胺合成酶基因的DNA靶序列，并可通过至少包括下述步骤的方法获得(a)构建第一系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第一功能性亚结构域位于I-CreI的28到40位，(b)构建第二系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第二功能性亚结构域位于I-CreI的44到77位，(c)从来自步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i) I-CreI位点-10到-8位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体，且(ii)+8 到+10位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列，(d)从来自步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i) I-CreI位点-5到-3位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体，且(ii)+3到 +5位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-5 到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列，(e)从来自步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i) I-CreI位点+8到+10位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体，且(ii)-10 到-8位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中 +8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列，(f)从来自步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i) I-CreI位点+3到+5位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体，且(ii)-5到-3 位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+3到 +5位的核苷酸三联体的反向互补序列，(g)将来自步骤(c)和步骤(d)的两个变体中沈到40位和44到77位的突变组合在单个变体中，获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，所述序列中(i)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体相同，( )+8到+10位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)_5到-3位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体相同，和(iν) +3到+5位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA 靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，和/或(h)将来自步骤(e)和步骤(f)的两个变体中沈到40位和44到77位的突变组合在单个变体中，获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，所述序列中(i)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体相同，(i i) -5到-3位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA 靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii) I-CreI位点+8到+10位的核苷酸三联体被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+8到+10 位的核苷酸三联体，和(iv) 10到-8位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(i)将步骤(g)和/或(h)中获得的变体相组合，以形成异二聚体，和(j)选择和/或筛选来自步骤(i)的能够切割来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列的异二聚体。2.权利要求1的变体，其中位于I-CreI之44到77位的亚结构域中的所述替换是在 44、68、70、75 和 / 或 77 位。3.权利要求1的变体，其中位于I-CreI之28到40位的亚结构域中的所述替换是在 28、30、32、33、38 和 / 或 40 位。4.权利要求1到3中任一项的变体，其中所述替换是用选自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、 S、Τ、Y、C、V、L、Μ、F、I和W的氨基酸替换原始氨基酸。5.权利要求1到4中任一项的变体，所述变体为第一和第二单体结合所得到的异二聚体，所述第一和第二单体在I-CreI的28到40位和/或44到77位具有不同的突变，所述异二聚体能够切割来自谷氨酰胺合成酶基因的非回文DNA靶序列。6.权利要求5的变体，其中所述DNA靶标来自人GS基因，并且选自序列SEQID NO 5 到28。7.权利要求5的变体，其中所述DNA靶标来自小鼠GS基因，并且选自序列SEQID NO 19 和 29 至 48。8.权利要求5的变体，其中所述DNA靶标来自中国仓鼠GS基因，并且选自SEQID NO 19、29、30、34、46、47 和 49 至 60。9.权利要求1到8中任一项的变体，其在I-CreI的137到143位上包含至少一个替换，所述替换改变所述变体对I-CreI位点中士 1到2、士6到7和/或士 11到12位核苷酸的特异性。10.权利要求1到9中任一项的变体，其在I-CreI全序列中包含至少一个替换，所述替换改进所述变体对来自谷氨酰胺合成酶基因之所述DNA靶标序列的结合和/或切割特性。11.权利要求10的变体，其包含选自下列的至少一个替换N2S、T3A、N6K、K7E、Y12H、 G19S、G19A、I24V、F35L、L39V、F43L、V45L、V45M、Q47K、Q50R、F54L、K57E、V59A、D60Y、V64A、 Y66H、E80K、F87L、F87I、Q92R、K96R、V105A、K107R、E110V、S114F、S114P、E117V、S118T、 P119L、D120A、D120E、V125I、V129A、I132V、D137N、D137Y、K139R、D153N、S154G、K160R、S161P 和 S161T。12.权利要求11的变体，其包含选自下列的至少一个替换G19S、F54L,E80K、F87L、 V105A 和 I132V。13.权利要求6和10至12中任一项的变体，其中第一和第二单体在观、30、32、33、38、 40、44、68、70、75、77位以及最后在80位分别具有选自下列的氨基酸KTSGQS/VERNR+K80 和 KRTNQQ/DRSRT、KNGCAS/1RSNR 和 KNSRDR/YASRI、KRTCQT/KYSEV 和 KRTNQQ/LRNNI+K80、 KNSCAS/NTSRY 和 KNSTAS/MERNR、KNSRNQ/RYSEV 和 ENSRRK/NRSRY、KNTCQS/LRANV 和 KYTCQS/DYSSR、KNHHQS/NQSSV 和 KNSEQE/AYSYK、KRCCQE/KTTNI 和 KNRDQS/ARSRL、KRSYQS/QESRR 和 KSSHKS/NYSRV、KNSTQS/ARSER 和 KNSPQQ/KYSEV、KDSRTS/RRSND 和 KNCCHS/RRSND、KNHHQS/ YYSST 和 KTSGQS/QRSYR、KTSGQS/KRSRR 和 KNSRAQ/NRSRY、KNSYQS/KYSNQ 和 ENSRRK/KYSQN、 KSSHKS/1RSNR 和 KNDYCS/KESDR、KNSTQT/QNSQR 和 KNSRAQ/AQNNI、KNSRDR/1RCNR 和 KRANQE/ ARSER、KNSPKS/NKHNI 和 RNSAYQ/DYSSR、KNSCAS/1RANR 和 KNTCQS/QRSHY、KNTYWS/ARSRL 和 KNSRNQ/YSSSD、KDSRSS/YRSDV 和 KNTYWS/DYSSR、KTSGQS/KRSDK 和 NNSSRK/AYSRI、KNSRNQ/ SRSYT 和 KDSRQS/KESDR、KNSCAS/ARSER 和 KRSRQS/QYRNI。14.权利要求7和10至12中任一项的变体，其中第一和第二单体在观、30、32、33、38、 40、44、68、70、75、77位以及最后在M或80位分别具有选自下列的氨基酸KNCCHS/KYSNI 和 KRSYQS/TYSRT、KRSRES/DYSYQ 和 KRGYQS/RHRDI、KRGYQS/KHRDI、KRGYQS/KNRDI、KRCYQS/ RHRDI、KRGYQS/NYSRY、KRGYQS/RTRDI、KRGYQS/TYSRV、KRGYQS/KARDI、KRG...
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