新颖的10-23脱氧核酶类似物及其用途制造技术

本发明专利技术涉及新颖的10-23脱氧核酶类似物及其用途。具体地，本发明专利技术涉及一种下式所示的10-23脱氧核酶催化结构域部分被修饰的10-23脱氧核酶类似物：其中各符号如说明书所述。本发明专利技术还涉及所述10-23脱氧核酶类似物的制备方法，包含它们的药盒、试剂盒、或组合物以及它们的用途。本发明专利技术鉴于各个核苷酸单元在10-23脱氧核酶的催化结构域中的保守性不同，和碱基的功能基对于催化反应的贡献，利用嘌呤核苷和嘧啶核苷的类似物取代其在催化结构域中的位置，获得了催化效率比原型10-23脱氧核酶高的新颖的脱氧核酶类似物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一类新颖的脱氧核酶类似物，特别是涉及一类新颖的10-23脱氧核酶类似物，以及它们的用途。
技术介绍
核酶是一类具有催化核酸裂解活性的天然核酸分子，它利用自身的高级结构和环境中的金属离子、水分子等参与，实现催化裂解核酸的功能。核酶的发现，不但使我们对于核酸的功能有了新的认识，而且为核酸的研究与应用提供了一个新的工具。经过科学家们的努力，已将核酶应用于催化裂解致病基因，使之失活的研究中，因而核酶也成为继反义核酸药物之后的又一类基因治疗候选药物。至今有多种基于核酶的药物处于研发阶段。但核酶的体内应用被如下因素所限制，它们的化学不稳定性和酶不稳定性，和核酶转运至作用靶点需要克服的障碍等。脱氧核酶的发现，又为改善核酶的药学性质提供了一个选择，因为脱氧核酶的化学和酶稳定性要高的多，而且，合成上更简便。最有潜力的脱氧核酶是10-23脱氧核酶，迄今已对它在针对致癌基因，病毒，和遗传突变基因等方面进行了研究。它的临床应用则受到不能在体内表达的限制，治疗性给药还存在转运技术的困难，但随着基因治疗转运技术的发展，外源性脱氧核酶的转运将会得到解决。另一个缺陷是其有效性需要远高于生理浓度的二价金属离子(如Mg2+)的参与。在一定范围内，Mg2+浓度越高，催化效率越高。在模拟生理条件下，2mM MgCl2,150mM KCl, pH 7. 5，37°C，kcat = 0. OlmirT1。而细胞内的 Mg2+生理浓度仅为0. 1-0. 2mM，在此浓度下，脱氧核酶的催化效率远远达不到用于治疗目的的要求。 因此，寻找在低Mg2+浓度下具有高效催化能力的新型脱氧核酶，将是发展脱氧核酶作为基因治疗药物的关键突破点之一。10-23脱氧核酶与底物结合的示意图如附图说明图1所示，图中，N’为底物的核苷酸单体组成，N为10-23脱氧核酶识别域的核苷酸单体组成，N为任一与靶核苷酸N’可以进行W-C 互补配对的核苷酸单元；R为嘌呤核苷酸单元，Y为嘧啶核苷酸单元，互补链部分的长度可随靶核酸的序列、碱基组成等因素的变化而变化，脱氧核酶两端的碱基数为η(例如η = 4-50)。基于脱氧核酶作为基因治疗药物的巨大应用潜力，针对它的化学修饰一方面是为了优化其药学性质，如提高它的酶稳定性和转运效率。另一方面是利用化学修饰探讨其催化机制，指导如何进一步提高其催化效率。迄今，通过化学修饰对这个脱氧核酶的机制和催化效率进行研究已有不少文献报道，但无论在机制上，还是在催化效率上都未取得突破性进展。所进行的化学修饰主要为以下三个方面，(1)逐个消除环内碱基，研究各个碱基对于催化效率的贡献；( 利用天然碱基对每个环内碱基进行替换，研究碱基上的功能基如氨基和羰基的缺失对于催化反应的影响；(3)利用非天然碱基，如2-氨基腺嘌呤和嘌呤等增加或减去功能基，但其研究范围多数仍然局限在参与Watson-Crick配对的功能基。在新型核酶的筛选中，还使用了氨基和咪唑基修饰的核苷类似物，这是基于核酸酶的裂解机制而选择的功能基引入策略。利用这些功能基的酸-碱性和成氢键能力，加强 2’ -0的亲核性，以及促进5’ -氧阴离子的质子化，是加速这一反应的主要策略。核酸碱基可能发挥这样的作用，但在生理PH条件下，其酸碱性没有达到最佳值。相关的现有技术可参考后文所附的参考文献。 因此，寻求具有更高催化效能的脱氧核酶，仍是本领域令人期待的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是寻找具有更高催化效能的10-23脱氧核酶类似物。 本专利技术主要选择以氨基、咪唑基、以及羟基为主的功能基，以各种连接臂将它们引入核苷单体，在一定的二价金属离子浓度和pH，37°C的条件下，通过评价它们处于10-23脱氧核酶的催化结构域的各个位点对催化活性的贡献，筛选更高效的脱氧核酶，同时，研究这些功能基特性以及空间取向对催化效率的影响并探讨可能的催化机制。本专利技术利用化学修饰法对 10-23脱氧核酶进行修饰，获得了在近似生理Mg2+浓度下，高于原型10-23脱氧核酶的具有高催化效率的10-23脱氧核酶类似物。本专利技术基于上述发现而得以完成。专利技术概沭本专利技术第一方面提供了一种10-23脱氧核酶催化结构域部分被修饰的10-23脱氧核酶类似物，其为下式所示3，-N1 N2 N3 N4 N5 N6 Ni+17Ni+18Ni+19Ni+2o……Nn_5，，或为下式所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．１０－２３脱氧核酶催化结构域部分被修饰的１０－２３脱氧核酶类似物，其为下式所示：３’－Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６……ＮｉＸ１５Ｘ１４Ｃ１３Ｘ１２Ｘ１１Ｃ１０Ｘ９Ｘ８Ｃ７Ｘ６Ｘ５Ｘ４Ｃ３Ｘ２Ｘ１ＲＮｉ＋１７Ｎｉ＋１８Ｎｉ＋１９Ｎｉ＋２０……Ｎｎ－５’，或为下式所示：３′－Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６．．．．．．Ｎｉ　　　　Ｒ　Ｎｉ＋１７Ｎｉ＋１８Ｎｉ＋１９Ｎｉ＋２０．．．．．．Ｎｎ－５′　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５Ｘ　　　　　　Ｘ１１４Ｘ　　　　　　　　Ｘ２　　　　　　　　　　　　　　　　　１３Ｃ　　　　　　　　　　Ｃ３　　　　　　　　　　　　　　　　１２Ｘ　　　　　　　　　　　　Ｘ４　　　　　　　　　　　　　　　　　１１Ｘ　　　　　　　　　　Ｘ５１０Ｃ　　　　　　　　Ｘ６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９Ｘ　　Ｘ８　　Ｃ７其中，Ｎ代表该１０－２３脱氧核酶类似物两端的识别部分，并且两端的碱基数量相同或不同，各自独立地为４至２５个；３’－Ｘ１５Ｘ１４Ｃ１３Ｘ１２Ｘ１１Ｃ１０Ｘ９Ｘ８Ｃ７Ｘ６Ｘ５Ｘ４Ｃ３Ｘ２Ｘ１－５’为催化结构域；ｎ为４－５０的整数；ｉ为４－３３的整数；所述的催化结构域部分是１０－２３脱氧核酶催化结构域部分中的第１、２、４、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５号残基中的任一个或多个各自独立地被选自以下式Ｊ、式Ｂ、式Ｄ、式Ｅ和式Ｆ的核苷类似物取代：Ｊ　　　　　　　　Ｂ　　　　　　　　Ｄ　　　　　　　　Ｅ　　　　　　　　Ｆ以上式Ｊ、式Ｂ、式Ｄ、式Ｅ和式Ｆ的核苷类似物中，各取代基各自独立地定义如下：（１）嘌呤核苷类似物Ｊ和Ｄ中，Ｚ各自独立地选自碳和氮原子，其中，当Ｚ为碳原子时，７位取代基Ｒ１各自独立地选自：氢、卤素（例如氟、氯、溴、碘）、拟卤素（例如氰基、硫氰基）、羧基、酰胺基（例如ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ７、ＣＯＮＲ７２）、Ｃ６－２０芳香基、Ｃ３－１０杂芳香基和杂环结构、Ｒ７、或Ｌ－Ｒ８，其中：Ｒ８选自羟基、氨基、Ｃ６－２０芳香基、Ｃ３－１０杂芳香基和杂环结构、ＯＲ７、ＮＨＲ７、ＮＲ７２、ＮＨＣＯＲ７（胺酰基）、胍基、取代的胍基ＮＨ－Ｃ（ＮＲ７２）＝ＮＲ７、巯基、ＳＲ７、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ７、ＣＯＮＲ７２、卤素（例如氟、氯、溴、碘）、拟卤素（例如氰基、硫氰基）、羧基，Ｌ是选自以下的连接臂：Ｃ１－１０直链或支链烷基臂（例如Ｃ１－６直链或支链烷基臂，例如亚甲基、１，２－亚乙基、三亚甲基，四亚甲基）、Ｃ２－１０不饱和烷基臂（例如Ｃ２－４不饱和烷基，例如烯键、炔键）、Ｃ３－１０环烷基臂，连接臂还可以是含酰胺键、酯键、醚键、硫醚键的直链和支链结构，Ｒ７各自独立地选自Ｃ１－１０直链或支链烷基（例如Ｃ１－６直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基）、Ｃ２－１０不饱和烷基（例如Ｃ２－４不饱和烷基，例如乙烯基、丙烯基、乙炔基、丙炔基）、Ｃ３－１０环烷基（例如Ｃ３－６环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基），以及含芳香环的直链和支链结构，所述芳香基和杂芳香基任选被一个或多个取代基Ｒ９取代，Ｒ９的定义与Ｒ７相同；（２）嘌呤核苷类似物Ｊ，Ｂ，Ｄ，Ｅ的２位取代基Ｒ２各自独立地选自：氢、氨基、羟基、胍基、卤素（例如氟、氯、溴、碘）、ＯＲ７、ＮＨＲ７、ＮＲ７２、ＮＨＣＯＲ７（胺酰基）、巯基、ＳＲ７、Ｃ６－２０芳香基、Ｃ３－８杂芳香基和杂环结构、Ｒ７，或Ｌ－Ｒ８，其中：Ｒ８选自羟基、氨基、Ｃ６－２０芳香基、Ｃ３－１０杂芳香基和杂环结构、ＯＲ７、ＮＨＲ７、ＮＲ７２、ＮＨＣＯＲ７（胺酰基）、胍基、取代的胍基ＮＨ－Ｃ（ＮＲ７２）＝ＮＲ７、巯基、ＳＲ７、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ７、ＣＯＮＲ７２、卤素（例如氟、氯、溴、碘）、拟卤素（例如氰基、硫氰基）、羧基，Ｌ是选自以下的连接臂：Ｃ１－１０直链或支链烷基臂（例如Ｃ１－６直链或支链烷基臂，如亚甲基、１，２－亚乙基，三亚甲基，四亚甲基）、Ｃ２－１０不饱和烷基臂（例如烯键、炔键）、Ｃ３－１０环烷基臂（例如Ｃ３－６环烷基），连接臂还可以是含酰胺键、酯键、醚键、硫醚键的直链和支链结构，Ｒ７各自独立地选自：Ｃ１－１０直链或支链烷基（例如Ｃ１－６直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基）、Ｃ２－１０不饱和烷基（例如Ｃ２－４不饱和烷基，例如乙烯基、丙烯基、乙炔基、丙炔基）、Ｃ３－１０环烷基（例如Ｃ３－６环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基），以及含芳香环的直链和支链结构，所述芳香基和杂芳香基任选被一个或多个取代基Ｒ９取代，Ｒ９的定义与Ｒ７相同；（３）嘌呤核苷类似物Ｊ和Ｂ的６位取代基Ｒ３各自独立地选自：氢、氨基、羟基、卤素、ＯＲ７、ＮＨＲ７、ＮＲ７２、ＮＨＣＯＲ７（胺酰基）、胍基、巯基、ＳＲ７、Ｃ６－２０芳香基、Ｃ３－２...

【技术特征摘要】
1. 10-23脱氧核酶催化结构域部分被修饰的10-23脱氧核酶类似物，其为下式所示2.权利要求1的10-23脱氧核酶类似物，其中N代表该10-23脱氧核酶类似物两端的识别部分，并且两端的碱基数量相同或不同，各自独立地为4至25个，与所针对的靶序列是以Watson-Crick互补配对的。3.权利要求1或2的10-23脱氧核酶类似物，其特征在于以下任意一项或任意多项a)η为4-50的整数，或者η为10-40的整数，或者η为15-40的整数，或者η为20-40 的整数，或者η为4-40的整数；b)i为4-33的整数，或者i为4-15的整数，或者i为4-12的整数，或者i为6-12的整数；c)所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第1、2、4、5、6、8、9、·11、12、14、或15号残基中的任一个被选自式J、式B、式D、式E和式F的核苷类似物取代， 或者所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第1、2、4、5、6、8、9、11、·12、14、或15号残基中的任2个或更多个被选自式J、式B、式D、式E和式F的核苷类似物取代；d)所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第5、9、11、12、或 15号残基中的任一个被选自式J或式B的核苷类似物取代，或者所述的催化结构域部分是 10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第1、2、6、或14号残基中的任一个被选自式D或式E的核苷类似物取代；或者所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分的第4、 或8号残基中的任一个被选自式F的核苷类似物取代。4.权利要求1至3任一项的10-23脱氧核酶类似物，其特征在于以下任意一项或任意多项a)所述的催化结构域部分是10-23脱氧核酶催化结构域部分中的第5、9、11、12、或15 号残基中的任一个被选自以下的的核苷类似物取代5.权利要求1至4任-6.权利要求1至5任一项的10-23脱氧核酶类似物，其可以用所涉及的核苷类似物J， B，D，E，F的核苷类似物对5个dA位点X5, X9, X11, X12, X15进行修饰(1)在5个dA位点X5，X9,X11, X12, X15的修饰中，化合物J，B, D，E，F都可插入这些位点，代替dA;(2)在5个dA位点X5,X9, X11, X12, X15的修饰中，优选选择化合物J和B代替dA ；(3)在5个dA位点X5,X9, X11, X12, X15的修饰中，它们都是可被取代的位置；(4)在5个dA位点X5,X9, X11, X12, X15的修饰中，在单一取代修饰中，以X9为优选修饰的位点；(5)在5个dA位点X5，X9，Xn，)(12，X15的修饰中，可以同时对多个位点(2-5个)进行修饰。7.权利要求1至6任一项的10-23脱氧核酶类似物，其4个dG位置的X1,X2，X6, X14都是可各自独立地任选被所涉及的核苷类似物J，B, D，E，F取代的位置，其中(1)在4个dG的位置，X1,X2, X6, X14的修饰中，化合物J，B, D，E，F都可插入这些位点， 代替dG ；(2)在4个dG的位置，X1,X2, X6, X14的修饰中，优选选择化合物D和E插入这些位点， 代替dG ；(3)在4个dG的位置，X6,X14的修饰中，在单一取代修饰时，以G2和G14为优选修饰的位点；(4)在4个...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘克良，何军林，张迪，王琦，徐亮，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：11