本发明专利技术涉及一组遗传构建体，其至少包含第一致重组构建体(i)和第二构建体(ii、iii或iv)，所述第一致重组构建体(i)具有至少两个与位点特异性内切核酸酶的DNA靶标位点之前和之后的基因组区域同源的部分，并且还包含插入所述同源部分的阴性选择标记和阳性选择标记以及其中可将目的序列克隆到邻近阳性选择标记的区域；所述第二构建体(ii、iii或iv)包含大范围核酸酶。本发明专利技术还涉及包含这些构建体的试剂盒以及使用该组构建体将目的序列引入到靶细胞、组织或生物体之基因组中的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的大范围核酸酶重组系统本专利技术涉及一组试剂，其允许将DNA序列引入靶细胞基因组中的特定位点。特别地，该DNA序列编码基因，并通过诱导型同源重组(homologous recombination,HR)事件被引入靶细胞中。本专利技术还涉及ー组遗传构建体，其包含与大范围核酸酶基因组靶位点侧翼的部分具有同源性的至少两个部分和阳性选择标记及阴性选择标记；以及涉及将DNA序列引入靶细胞基因组的改进方法。自超过25年前酵母中的首个基因祀向实验(Hinnen等，1978 ;Rothstein, 1983)以来，已在多种细胞中采用同源重组(HR)来插入、替换和缺失基因组序列(Thomas和Capecchi, 1987 ；Capecchi, 2001 ；Smithies, 2001) 哺乳动物细胞中革巴向事件的发生频率非常低，使得对天然HR的利用变得不切实际。可以通过基因座处的特定DNA双链断裂(DNAdouble-strand break, DSB)来显著提高同源重组的频率(Rouet 等，1994 ;Choulika 等，1995) ο该DSB可以由大范围核酸酶(meganuclease)诱导,所述大范围核酸酶是识别大DNA识别靶位点(12至30bp)的序列特异性内切核酸酶。 大范围核酸酶对其DNA靶标表现出高特异性，这些蛋白质可切割独特的染色体序列，因此不影响全基因组完整性。天然大范围核酸酶主要以归巢内切核酸酶(homingendonuclease)为代表,所述归巢内切核酸酶是见于真核细胞、细菌和古细菌(archae)中的一类广泛分布的蛋白质(Chevalier和Stoddard, 2001)。对Ι-Scel和HO归巢内切核酸酶的早期研究已阐明了可如何将这些蛋白质的切割活性用于启动活细胞中的HR事件，并且已证明了 染色体 DSB 致重组特性(recombinogenic property) (Dujon 等，1986 ；Haber,1995)。从那时起，大范围核酸酶诱导的同源重组已成功地在细菌(Posfai等，1999)、哺乳动物细胞(Sargent 等，1997 ；Donoho 等，1998 ；Cohen-Tannoudji 等，1998)、小鼠(Gouble等，2006)和植物(Puchta等，1996 ;Siebert和Puchta，2002)中用于基因组工程目的。最近，已改造TAL效应子内切核酸酶(TAL effector endonuclease, TALEN)以高特异性地识别和切割DNA靶标。这些TALEN包含与核酸酶结构域(例如，FokI)融合的TAL (转录激活因子样)效应子DNA结构域(Christian等,2010)。另ー类核酸酶也可用于切割基因组靶并因此诱导DSB，该另ー类核酸酶被称为锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN),并且是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合产生的人造限制酶。可以以与TAL类似的方式改造锌指结构域以靶向任意DNA序列(Kim 等，1996)。虽然可获得可在靶细胞基因组中特定位点处诱导DSB的材料在増加，但是还未开发出常规可重复地转化靶细胞群的方法和材料。所存在的多种原因包括原核生物基因组或更特别是真核生物基因组固有的复杂性。工作人员越来越多地发现基因组具有卓越的抗损伤能力，这恰是DSB的本质所在。此外，在产生转化方法中，对所有转化方法而言都存在的技术限制(即从背景未转化细胞群中常规地鉴别出稀少转化体的能力)继续表现出问题。提供了利用HR在将目的序列引入靶细胞或生物体的基因组中任意位点的潜能的方法，从而允许可能比以往任何时候更细致地进行基因组操作。本专利技术的专利技术人现在已开发出一组新的遗传构建体，其包含a)由核酸分子编码的构建体(i)，其至少包含以下组分(N) n-H0M01-P-M-H0M02- (N)m(i)其中，η和m是整数并且代表O或I,前提是η = I时，m = 0而当η = 0时，m =I ;因此组分N可设置在H0M01之前或N0M02之后，并且，组分P和M在H0M01与H0M02之间的顺序可设置为P-M或M-P ；其中N 包含组分(PROMl)-(NEG)-(TERMl) ;P 包含组分(PR0M2) - (POS) - (TERM2)并且 M 包含组分(PR0M3)-(MCS)-(TERM3);以及其中PROMl是第一转录启动序列；NEG是阴性选择标记；TERM1是第一转录终止序列；H0M01是与核酸酶DNA靶序列之前的基因组部分具有同源性的一部分；PR0M2是第二转录启动序列；P0S是阳性选择标记；TERM2是第二转录终止序列；PR0M3是第三转录启动序列；MCS是多克隆位点，其中可以插入目的基因(gene of interest, GOI) ;TERM3是第三转 录终止序列；H0M02是与大范围核酸酶、TALEN或ZFN的所述DNA靶序列之后的基因组部分具有同源性的部分；b)至少ー种选自包括构建体(ii)或(iii)组成的组的构建体,所述构建体(ii)或(iii)由至少包含ー种以下组分的核酸分子编码PR0M4-NUCl(ii)；NUC2(iii);或该组还包含序列(iv)，其为至少包含以下组分的分离或重组蛋白质NUC3 (iv)；其中PR0M4是第四转录启动序列；NUC1是大范围核酸酶、TALEN或ZFN的开放读码框(ORF) ；NUC2是所述大范围核酸酶、TALEN或ZFN的信使RNA(mRNA)形式；NUC3是所述大范围核酸酶、TALEN或ZFN的分离或重组蛋白质；其中来自构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)的所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN识别并切割所述DNA靶序列；并且其中构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)设置成与构建体(i)共转染到至少ー种靶细胞中。更一般地，任何能够特异性地切割基因组靶并因此诱导DSB并且具有12至45bp双链DNA靶序列的核酸酶均可用于本专利技术中。本专利技术所包含的核酸酶的非限制性实例有大范围核酸酶、TALEN、ZFN，但本专利技术也可以与定义为任意融合蛋白的嵌合内切核酸酶并用，所述融合蛋白至少包含一种能够切割基因组靶并因此诱导DSB并且具有12至45bp双链DNA靶序列的内切核酸酶。除了可在特定基因组靶标处诱导DSB的核酸酶以外，本专利技术还包括可在12至45bp的特定基因组祀序列处诱导单链断裂(single strand break, SSB)之核酸酶的用途。SSB还称为缺ロ(nick)并且这种缺ロ核酸酶明确地包括在本专利技术中。在图I中以非限制性方式示出本专利技术的构建体，整合基质和核酸酶表达质粒被共转染到细胞中。基于共转染，经改造的核酸酶被表达，识别其内源识别位点，与其结合并在该特定位点诱导DNA双链断裂。细胞感知DNA损伤并触发同源重组以对其进行修复，采用经共转染的整合基质作为DNA修复基质，因它包含与周围断裂DNA同源的区域。在该重组事件期间，克隆到整合基质的同源区之间的阳性选择标记(POS)和GOI在大范围核酸酶识别位点被整合。于是，可以选择稳定的靶细胞克隆用于药物抗性和目的重组蛋白的表达。下文中提供了可用于本专利技术构建体之遗传元件类型的实例。这些实例仅为本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托夫·德朗达，让皮埃尔·卡巴尼奥尔斯，
申请(专利权)人：赛莱克蒂斯公司，
类型：
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。