利用含有硼葡萄糖酸钙络合物的培养基生产胸膜炎肺炎放线杆菌毒素ＡｐｘＩ的方法技术

本发明专利技术属于一种在能够支持细菌生长的液体培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）生产ＲＴＸ－毒素ＡｐｘＩ的方法。培养基中加入钙盐用来产生钙离子，与培养基中含有的硼葡萄糖酸结合生成硼葡萄糖酸钙络合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用含有硼葡萄糖酸钙络合物的培养基生产胸膜炎肺炎放线杆菌毒素Apx I的方法本专利技术涉及一种通过在能够支持细菌生长的液体培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)生产RTX-毒素ApxI的方法，其中在所述培养基中加入钙盐以在培养基中生成钙离子。猪胸膜肺炎是猪的一种主要的呼吸系统疾病，已经蔓延到全世界范围，由于高急性死亡、治疗急性病猪和销售慢性感染动物的延误，给养猪业带来严重的经济损失。猪胸膜肺炎的病原体是胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae) 0其主要通过动物间直接接触传播，这种感染在病程上有急性和慢性的不同。此疾病的病症主要是呼吸道感染，临床表现为高烧、严重的呼吸窘迫、咳嗽和厌食。此疾病发病很快，发病率和死亡率很高。控制胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)(以下称之为APP) 感染的方法之一是疫苗接种程序。过去曾接种菌苗，但公知的是这种方法具有严重的副作用。现在通常使用的是基于APP病毒的亚单位疫苗。APP产生的所谓RTX毒素(RTX指的是重复子毒素)。正是由于这些RTX-毒素的存在才在很大程度上导致了这种细菌的致病性。RTX-毒素过去被广为综述，文献中也多有描述。众所周知，并不是每种APP的血清型都能产生全部RTX-毒素，如1、5、9和11血清型产生ApxI和ΑρχΙΙ，2、3、4、6和8血清型产生ApxII和ApxIII，10血清型只产生ApxI，7和 12血清型只产生ApxII。现在市场上用于抗APP的疫苗是基于ΑρΧΙ、ΑρΧΙΙ和ApxIII毒素的。新近发现所有的APP血清型都产生第四种RTX-毒素，现在这种毒素被称之为ApxIV (参见 EP 0 875574)。如何在添加了钙盐(即基于酸的一种化合物，通过一个或多个钙离子完全或部分替换酸中的氢离子形成)的培养基中，通过培养胸膜炎肺炎放线杆菌生成RTX-毒素ApxI 已经很清楚了。特别是在专利ΕΡ0453 0 中已经阐述了此种方法(见“Example 2”，第2段 “溶血素的纯化和鉴定”，子段落“Methods”)。需要注意，ApxI过去被称之为溶血素(“HLY”) (Frey 等，在 J Gen Microbiol，1993 年 8 月；139 (8) :1723-8)。从这项 EP 专利可以知道， 培养基中加入钙化合物(CaC12)。的确，在Microbiol Pathogenesis 37 (2004)四_33中已经提到，在生长培养基中加入钙可以增强ApxI操纵子的转录活性。如此以来，可以获得高含量的ApxI。培养基应支持APP细菌的生长。已经公知如何去构建支持细菌生长的培养基。传统的培养基最初在上世纪五六十年代由fegle、Ham等人研制，他们发现能够满足细菌基本生长需要的培养基应含有无机盐、氮源(例如肽或蛋白质等含氮化合物)、碳源和维生素。培养基有利地被缓冲，以防止培养基酸性过强或者碱性过强。根据此基本配方，很多不同的组合方式都是可用的。例如，可以选择动物来源成分提供氨基酸，也可以选择化学限定的氨基酸。对于其他化合物，也可有多种不同的选择。的确，构建能够支持细菌生长基本要求的培养基相对来说比较简单。然而，(构建能)优化生长和(或)代谢产物(的培养基)需要一定的研制时间，特别是当一种培养基首选的是不含血清或其它动物源成分时。 在该
内，提高发酵培养基性能的方法是公知的，并在文献中有详细的阐述(例如见 Kennedy 和 Krouse 在 Journal of IndustrialMicrobiology & Biotechnology (1999),23,456-475)中的综述)。在发酵实验室，这种优化(培养基)构成了常规实验的一部分。 培养APP时，因为APP是NAD (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)依赖型的，所以从本质上说NAD属于培养基的一部分。培养基中若不含NAD，则不能支持胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的生长，因此从本申请和所附权利要求意义上来说，也不能认为是支持 APP生长的液体培养基。支持细菌生长的培养基，或者组成这些培养基的成分，可从很多公司如 Sigma Aldrich、Quest International、Oxoid、Becton Dickinson、Pharmacia、VGD Inc、Mediatech，、Invitrogen,、MarcorΛ Irvin Scientific 等购得。尽管从经济角度来看，现有技术方法足够可以获得相关产量的Apx I毒素，但是申请人认为有对方法实施改进的可能。发酵过程中培养基会变浑浊。申请人的贡献在于认识到这可能是由于一种(或多种)钙盐形成的沉淀。APP产生二氧化碳的同时，即会导致培养基中含有碳酸根离子。碳酸钙是一种溶解度非常低的盐，因此可能会造成一些问题。首先， 可以肯定的是钙离子参与沉淀，进而无法被APP细菌利用。第二，沉淀的钙盐会给下游工序带来问题。具体而言，过滤器将变得淤积。因此，申请人在培养基中添加不同的络合剂来考察其是否能够阻止盐的沉淀。以添加EDTA为例，(加入络合剂)的确可以使培养基仍能保持或多或少的透明度，但是ApxI毒素的产量却因使用EDTA络合剂而降低。因此这种前提可能是错误的或者不成功的。毕竟，提高ApxI毒素的产量是人们不懈的追求。令人惊讶的是，已经发现，与现有的不添加络合剂或依赖其他络合剂的技术方法相比，添加硼葡萄糖酸(分子式2，3- 二羟基-3-丙酸，参见莫里登研究所的Herbert Taylor MacPherson和 James Stewart于1937年11月16日被《生物化学杂志》接收的“硼葡萄糖酸钙的性质研究”)络合钙离子，可以获得高含量的ΑρχΙ。显然，使用这种特殊的络合剂，培养基中会含有硼葡萄糖酸钙络合物(如可用D-葡萄糖酸，具有硼酸的环状4，5-酯，钙盐2 1)，阻止了钙离子与其他阴离子结合生成牢固的沉淀，与此同时，钙离子仍可以用来提高胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)的ApxI操纵子转录活性。显然，钙离子会“嵌合”在盐络合物里。一方面，这种“嵌合力”足够强到可以阻止钙离子与碳酸盐或其他阴离子形成沉淀，另一方面，不妨碍细菌自身犹如钙离子游离在溶液中(即，只与水分子结合)那样利用钙离子。很明显，硼葡萄糖酸使得APP生产ApxI的临界平衡得以完全实现。在一具体实施方式中，硼葡萄糖酸的浓度应低于60mmol/L。超过这个浓度时ApxI 产量会下降。尽管仍可以用，但优选浓度应低于这个值，浓度在25-45mmol/L之间比较适合，特别是当浓度为40mmol/L时，看起来对一些培养基是最佳的。培养基最好不要含有动物源成分，尽管这对本专利技术不是必要的。很多现行技术方法的一个缺点是他们依赖于使用含有的动物源成分的培养基，比如Columbia肉汤。其他动物源成分在现行方法中也被提到，比如Columbia Broth modified或者Brain Heart hfusion肉汤本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．通过在支持细菌生长的培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）生产ＲＴＸ－毒素ＡｐｘＩ的方法，所述培养基中加入钙盐以在培养基中产生钙离子，其特征在于所述培养基含有硼葡萄糖酸来在培养基中生成硼葡萄糖酸钙络合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：SJ·斯莱格曼，
申请(专利权)人：英特威国际有限公司，
类型：发明
国别省市：NL