本发明专利技术涉及通过在支持细菌生长的液体培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌细菌来生产ＲＴＸ－毒素ＡｐｘＩ或ＡｐｘＩＩＩ的方法，其特征在于空气经过培养基，其中所述空气具有超过正常大气水平的二氧化碳含量，以增加在ＲＴＸ－毒素生产期过程中的ＲＴＸ－毒素生产。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在富含二氧化碳的空气供应下在液体培养基中生产胸膜炎肺炎放线杆菌毒素APXI或APCI I I的过程本专利技术涉及通过在液体培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)生产 RTX-毒素 ApxI 或 ApxIII 的方法。猪胸膜肺炎，猪中的主要呼吸性疾病，在全世界传播，并且由于过急性死亡、急性病猪的治疗和慢性感染动物销售中的延迟，引起养猪业的重大经济损失。病原体是胸膜炎肺炎放线杆菌。它主要通过动物间的直接接触传染，并且所得到的感染产生从过急性到慢性不等的临床过程。该疾病主要是呼吸道感染，具有高热、严重呼吸性窘迫、咳嗽和厌食的临床体征。该疾病的发作是快速的，并且发病率和死亡率很高。控制胸膜炎肺炎放线杆菌 (从现在开始也称为“APP”)感染的方法之一是通过疫苗接种程序。菌苗在过去已用于此类程序中，但因其严重副作用而众所周知。现今基于APP毒素的亚单位疫苗是常用的。APP产生所谓的RTX-毒素(RTX代表重复子毒素(r印eat-in-toxin))。正是这些 RTX-毒素的存在高度促成这种细菌的致病性特征。RTX-毒素已在过去得到广泛综述，并且在文献中得到描述。如通常已知的，并非所有APP血清型都产生所有RTX-毒素。例如，血清型1、5、9和11产生ApxI和ΑρχΙΙ。血清型2、3、4、6和8产生ApxII和ApxIII。血清型 10仅产生ApxI，并且血清型7和12仅产生ApxII。针对APP的目前商购可得疫苗基于毒素 ApxI、ApxII和ApxIII。最近以来已发现所有APP血清型都产生第4种RTX毒素，目前称为 ApxIV (参见 EP 0 875 574)。目前已知如何通过在液体培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌来生产RTX-毒素 ApxI或ΑρχΙΙΙ。特别地，EP 0 453 OM已描述了生产ApxI的方法(参见“Example 2”， 1 2 "Purification andcharacterisation of hemolysin",子·( 胃“Methods，，)禾口 ΑρχΙΙΙ (参见“实施例4，，,段落2“Purification and characterisationof App macrophage toxin (Mat)”，子段落“Methods”)。应当指出ApxI习惯被称为“HLY”，而ΑρχΙΙΙ通常被称为 “Mat”(参见 Frey 等人在〃 J Gen Microbiol. 1993 Aug; 139 (8) :1723-8"中)。培养基必须支持APP细菌的生长。通常已知如何构成支持细菌生长的培养基。标准培养基最初由fegle，Ham及其他人在20世纪50年代和60年代开发。他们发现满足生长的基本需要的培养基应包括无机盐、氮源(例如以含氮化合物的形式，例如肽或蛋白质)、碳源和维生素。培养基有利地进行缓冲以阻止其变得太酸或太碱。在这个基本配方内，许多不同构成是可获得的。例如，可以选择动物衍生的组分以提供氨基酸，但也可以选择化学成分限定的氨基酸。对于其他化合物，众多变化也是可能的。事实上，构成支持细菌生长的培养基是相对简单的。然而，生长和/或代谢产物生产的最佳化可以花费一定的开发时间， 特别是当不含血清或其他动物衍生的组分的培养基是优选的时。然而，用于改善发酵培养基性能的策略是本领域通常已知的，并且在文献中得到充分描述(参见例如由Kennedy 禾口 Krouse 在 Journal ofIndustrial Microbiology & Biotechnology (1999)23，456-475 中的综述文章)。此类最佳化构成发酵实验室内的常规实验部分。在APP培养的情况下， NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)固有地构成培养基的部分，因为APP是NAD依赖性的。如果没有NAD，那么培养基将不支持胸膜炎肺炎放线杆菌细菌生长，并且因此不能被视为在3本申请和附加权利要求含义中用于支持APP生长的液体培养基。用于支持细菌生长的液体培养基，或构成此类培养基的组分，可从各个公司商购得到，例如Sigma Aldrich、Quest International、OxoicU Becton Dickinson、Pharmacia、VGD Inc、Mediatech、Invitrogen、 Marcor> IrvinScientific 等。尽管现有技术提供了通过培养APP生产RTX-毒素ApxI和ApxIII的方法，但需要改善生产得率。迄今为止，改善生产得率的尝试主要针对APP培养静止期中的毒素生产率， 因为已知最大限度RTX-毒素生产在高细胞密度时发生，因此在指数生长期结束时发生(参见例如Microbial Pathogenesis 37 Q004)四_3；3)。这些尝试未导致总体生产得率的显著改善。然而，令人惊讶的是，申请人发现当空气在胸膜炎肺炎放线杆菌的所述RTX-毒素的生产期过程中(因此在APP细菌的生长和/或静止期过程中)经过培养基时，其中所述空气具有超过正常大气水平的二氧化碳含量，RTX-毒素生产得到显著增加。事实上，一般已知在平板上在细菌菌落培养过程中使用增加的二氧化碳水平(参见例如US 6，019，984:实施例〃 Bacterial Strains and GrowthConditions〃)。然而，这涉及细菌菌落的培养，所述细菌随后用于接种发酵罐。在这个阶段时，仅发生细菌其自身的生长，不发生RTX毒素的生产(至少不以显著水平)。一旦将APP细菌置于液体培养基中以朝向适合于RTX毒素生产的高细胞密度生长，现有技术就教导免除增加的二氧化碳水平。这当然与上文提及的现有技术教导一致在发酵罐中的最大限度Apx生产仅在高细胞密度下发生，因此在指数生长期结束时发生。在这个阶段时，细胞生长已结束并且完全不再变动(Plays no roll)，并且因此二氧化碳先前被视为不是重要的。此外，APP细菌其自身在形成RTX-毒素时生产二氧化碳。因此，有目的的将二氧化碳加入培养基中被认为甚至抑制毒素生产。这些事实解释了为何二氧化碳从未被认为是关于RTX-毒素生产得率的刺激因子。然而，为何二氧化碳的确刺激ApxI和ApxIII生产的原因仍不明了，特别是因为二氧化碳似乎对RTX-毒素ApxII 的生产水平没有正面作用。应当指出存在使得空气能够经过培养基的许多技术。常用概念是经由使空气以气泡的形式在某处漏出到培养基内(即在培养基表面下)的装置使空气通过。此类装置可能具有一个单喷嘴或多个喷嘴，依赖于是否希望建立培养基中的(近)平衡状态，并且如果希望，那么这个平衡应多快确定。在任何情况下，使空气经过培养基与使用空气的顶部空间且仅仅主要依赖于扩散形成对比。已发现此类技术提供不充足的结果。在本专利技术背景下的 “空气”意指包含通常存在于大气空气中的一种或多种气态组分的气态介质，所述气态组分例如氧、氮、二氧化碳、氦、氖、氩、氙、氡等。“关于二氧化碳的正常大气水平”是空气总体积的 0，04% 体积 CO2，，。在一个实施方案中，空气在胸膜炎肺炎放线杆菌细菌的指数生长期过程中通过。 与现有技术中已描述的形成对比，指数生长期看起来是R本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．通过在支持细菌生长的液体培养基中培养胸膜炎肺炎放线杆菌细菌来生产ＲＴＸ－毒素ＡｐｘＩ或ＡｐｘＩＩＩ的方法，其特征在于空气在所述ＲＴＸ－毒素的生产期过程中经过所述培养基，其中所述空气具有超过正常大气水平的二氧化碳含量。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：SJ·斯莱格曼，
申请(专利权)人：英特威国际有限公司，
类型：发明
国别省市：NL
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