本发明专利技术属于抗结核感染免疫的技术领域，具体说是从结核杆菌同时提取可刺激αβT细胞和γδT细胞的蛋白类抗原的方法。本发明专利技术包括以下步骤：(1)将结核杆菌接种在苏通培养基培养2周后收集上清，经超滤柱(截留分子量3kDa)离心浓缩获取早期分泌蛋白，为刺激αβT细胞的抗原；(2)结核杆菌用含10％小牛血清苏通培养基再培养4周后收集菌体，加水高温处理后离心收集上清，先经超滤柱(截留分子量30kDa)离心，滤过液再经超滤柱(截留分子量3kDa)离心浓缩，获取截留的低分子蛋白成分为刺激γδT细胞的抗原。本发明专利技术的优点是：培养条件和操作较简便，能在短期内同时制备可刺激αβT细胞和γδT细胞的蛋白抗原。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗结核分枝杆菌感染的细胞免疫学
，具体地说是一种同时提取可刺激α βT细胞和Y δT细胞增殖的结核杆菌蛋白质抗原的方法。
技术介绍
由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染引起的结核病，目前仍是发病率和病死率最高的传染病之一。然而迄今为止，关于结核病的发病机制，特别是机体对Mtb感染的免疫机制并未完全阐明。以前的大量研究报道证明T细胞特别是普通T细胞即α 01~细胞(包括00411细胞和00811细胞)和巨噬细胞在抗结核杆菌感染的免疫保护作用中起着关键性的地位，因此对于探讨涉及免疫保护作用或致病性的结核杆菌的抗原也是集中在α β T细胞所识别的是抗原及其表位。但近年来，另外一类数量较少的T细胞即Yδ T细胞在抗结核感染免疫的中的保护作用，或者可能参与致病的作用，也已日益得到关注和重视。由于这类Y S T细胞在识别抗原的方式与普通的α β T细胞有所不同，可以以 MHC非限制性方式识别肽类和非肽类抗原。因此，多数研究者关注Y δ T细胞对非肽类抗原如磷酸类抗原的识别方式和机制，而对来自结核杆菌的蛋白多肽抗原的识别的研究报道较少。美国学者Boom曾报道来自结核杆菌的耐热性的低分子蛋白，可以特异性优先激活人YST细胞的增殖。我们在十多年前就开始应用这种抗原探讨Y δT细胞在抗原识别和激活后的信号转导的机制，以及比较这种抗原对结核病患者和健康个体的Y S T细胞的激活和诱导凋亡作用方面的差异。由于最早报道的制备这种耐热性抗原的过程较漫长和繁琐， 获得量不高，特别是各制备批次之间的活性差别较大。另外，在多数对α βΤ细胞识别结核杆菌分泌性抗原的研究也仅是关注少数蛋白抗原的表位，而不能从蛋白组学和抗原组学的角度深入了解α βT细胞对结核杆菌抗原库的识别。因此，对T细胞识别结核杆菌抗原库的研究需要重视这两类T细胞，S卩α βT细胞和γ δT细胞所识别的抗原进行更为深入的探索研究，也就需要建立可以同时提取刺激α βT细胞和γ δT细胞活化和增殖的结核杆菌抗原的方法，以满足对这两类T细胞所识别的抗原的实验研究需要。这对于全面和确切深入了解机体在结核杆菌感染的免疫保护作用和病理机制，有重要的学术探讨意义和临床实用价值。
技术实现思路
本专利技术目的在于建立一种实用而有效的从结核分枝杆菌同时提取可刺激两类T 细胞增殖的蛋白质抗原的方法，其设计原理和操作方案是采用分步培养法和超滤技术批量制备结核分枝杆菌分泌性蛋白抗原和菌体耐热性低分子蛋白抗原，可分别有效地刺激 α βT细胞和γ δT细胞的增殖。本专利技术的方法包括以下步骤1.将结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，如H37Ra)接种于不含血清或其他蛋白的结核杆菌液体培养基。通常用苏通氏液体培养基或者Middlebr00k7H9，置37度温箱培养2周左右时，收集培养上清。此培养上清即为结核杆菌的早期培养上清，含有结核杆菌分泌性蛋白。2.将上述结核杆菌的早期培养上清，放入超滤柱(截留分子量3kDa)中，离心， 4000r/min，40分钟，收集截留物后，再加少量(如0. 5ml)洗涤超滤柱膜，收集残留液体与收集截留物合并，即为浓缩的结核杆菌分泌性蛋白，是特异性刺激α βΤ细胞活化和增殖的蛋白抗原。3.将上述离心沉淀的结核杆菌加入含有约10%新生牛血清的结核杆菌液体培养基，如苏通氏液体培养基或者Middlebrook 7Η9，或将菌体接种于结核杆菌的固体培养基， 如罗-琴氏培养基，或Middlebrook 7Η10和7Η11等固体培养基，置于37度温箱培养5周左右，即约在32天至38天时收集菌体。4.将上述收集的结核杆菌菌体加2倍体积纯水，在高压灭菌器，于115°C至121°C 处理20或者30分钟，离心收集上清液，即为含有刺激α β T细胞和γ δ T细胞的蛋白抗原。5.将上述高温处理的结核杆菌上清液，移入到超滤柱(截留分子量30kDa)，离心过滤，4000r/min，40 60分钟，收集截留物为富含刺激α β T细胞的大分子蛋白抗原，可与上述步骤2收集的结核杆菌分泌性蛋白合并一起，作为特异性刺激α β T细胞的蛋白抗原。6.经上述超滤柱(30kDa)离心过滤后的滤过物，再放入超滤柱(截留分子量 3kDa)离心，4000r/min，40分钟后，收集截留物，即为浓缩的富含低分子蛋白多肽组分，是特异性刺激Y ST细胞活化增殖的耐热性低分蛋白抗原。7用结核杆菌早期分泌蛋白质抗原和菌体释放耐热性低分子蛋白抗原，在体外分别刺激人外周血α β T细胞和γ δ T细胞增殖，具体方法如下(1)人外周血采集后用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离获取单个核细胞，用含10%新生牛血清的RPMI1640培养液制备细胞悬液后放入M孔培养板，加入可刺激人α βΤ细胞的结核杆菌早期分泌蛋白质抗原，最适使用终浓度为5 10yg/ml，或者加入可刺激人Y ST细胞活化增殖的结核杆菌菌体耐热性低分子蛋白抗原，最适使用终浓度为4 8μ g/ml。(2)将培养板置于(X)2培养箱，于37°C，5% CO2和饱和湿度下培养，(3) 在培养开始或者培养3天后，加入人重组IL-2，终浓度为20 50u/ml，并每隔3 4天补充同样剂量的IL-2。(4)在培养过程中，每隔3 4天观察细胞增殖，根据细胞增殖程度分孔扩大培养；(5)在培养第7 9天时，或者更长天数时，取出扩增培养的细胞，通常大多数是T细胞，并计数扩增的细胞数量。(6)取出的扩增细胞用荧光标记单抗染色后，在流式细胞仪上检测T细胞表型，计算不同T细胞亚群，即α β T细胞中的⑶4+Τ细胞和⑶8Τ+细胞，以及Y S T细胞的比例以及扩增的细胞数量，并计算扩增倍数。8.结核杆菌早期培养上清经过超滤柱离心浓缩的结核杆菌早期分泌蛋白质抗原，以及菌体释放耐热性蛋白抗原经过超滤柱离心浓缩分离后的低分子蛋白的分子量鉴定，通过应用常规的聚丙烯凝胶电泳 (SDS-PAGE)，和快速蛋白液相层析系统(FPLC)进行。本专利技术的方法的主要特点是⑴重视和增加对刺激Y δ T细胞的蛋白多肽抗原的提取方法。( 除了提取结核杆菌中特异性刺激α β T细胞分泌性抗原外，在提取刺激 Y S T细胞的抗原组分时，同时分离和收集能刺激α β T细胞的大分子蛋白抗原，扩大了刺激α βΤ细胞的抗原库。(3)在制备抗原时，采取不同的培养条件培养结核杆菌。为获取单纯的结核杆菌分泌性抗原时，用不含任何蛋白成分的基础液体培养基，如苏通氏液体培养基培养；在需要快速生长培养结核杆菌菌体时，则在培养基中添加含量较高的新生牛血清。(4)充分利用超滤的原理和技术，采用和组合不同截留分子量的超滤膜分离和浓缩刺激 Y S T细胞和α β T细胞的抗原。(5)缩短实验过程，充分利用和节省资源。附图说明。图1.结核杆菌分泌性蛋白的电泳结果结核杆菌的早期培养上清，经过超滤柱(截留分子量3kDa)离心浓缩后的分泌蛋白，在SDS-PAGE凝胶上电泳，经过考马斯亮兰染色后的条带，显示含有多个蛋白组分，右侧为蛋白分子量标准。图2.结核杆菌菌体耐热性蛋白成分经超滤柱分离为大分子和低分子两个组分结核杆菌菌体高温处理上清含释放的菌体混合蛋白，经过两种不同截本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种从结核分枝杆菌同时提取可刺激两类Ｔ细胞增殖的蛋白质抗原的方法，其特点是采用分步培养法和超滤技术制备结核分枝杆菌分泌性蛋白抗原和菌体耐热性低分子蛋白抗原，可分别刺激αβＴ细胞和γδＴ细胞的增殖。本专利技术的方法包括以下步骤：（１）将结核分枝杆菌接种于不含血清或其他蛋白的结核杆菌液体培养基，置３７度温箱培养２周左右时，收集培养上清。（２）将上述结核杆菌的早期培养上清经过超滤柱（截留分子量３ｋＤａ）离心收集截留物，即为浓缩的结核杆菌分泌性蛋白，是刺激αβＴ细胞增殖的蛋白抗原。（３）将上述离心沉淀的结核杆菌加入含有５～１５％动物血清的结核杆菌液体培养基，或将菌体接种于适合于培养结核杆菌的固体培养基，置于３７度温箱培养４周～６周时收集菌体。（４）将上述收集的结核杆菌菌体加入１至３倍体积纯水，在高压灭菌器设置于１０５℃至１２３℃处理１０至３０分钟，离心收集上清液，即为含有刺激αβＴ细胞和γδＴ细胞的蛋白抗原。（５）将上述高温处理的结核杆菌上清液先经超滤柱（截留分子量３０ｋＤａ）离心过滤，收集的截留物为富含刺激αβＴ细胞的大分子蛋白抗原。（６）经上述超滤柱（３０ｋＤａ）离心过滤后的滤过物，再经超滤柱（截留分子量３ｋＤａ）离心后，收集截留物，即为浓缩的富含低分子蛋白多肽组分，是特异性刺激γδＴ细胞活化增殖的耐热的低分蛋白抗原。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，李柏青，马飞，彭美玉，胡中浩，
申请(专利权)人：蚌埠医学院，
类型：发明
国别省市：34
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