从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了浙江枝吻纽虫体壁通过RNA提取、cDNA合成、酶切、连接转化、重组质粒转化、重组蛋白诱导表达和重组蛋白的分离纯化，cDNA合成后用适合的双酶切引物进行PCR扩增得到目的片段的PCR产物，对引物和适合的表达载体双分酶切后连接，再转化到适合的宿主，分离纯化采用Ni-NTAHis.BindResin试剂盒的改进操作的方法，在非变性的条件下进行，从而省却了繁琐的复性步骤，也更有利于保持重组蛋白的天然活性，得到纯度较高的重组凝溶胶蛋白，本法制备的重组凝溶胶蛋白以可溶性的形式存在，且浓度约为85%，对肿瘤细胞呈现出明显的抑制作用，本发明专利技术的方法科学合理，简便易行，易于推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及凝溶胶蛋白的制备方法，具体涉及。
技术介绍
凝溶胶蛋白(Gelsolin)最早是在兔肺的巨噬细胞中发现，是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，其参与到细胞运动、细胞程序性死亡等生命活动中。目前凝溶胶蛋白的研究主要集中在结构、作用机制以及对某些疾病的影响；已有研究显示，凝溶胶蛋白具有治疗感染和治风湿性炎症的作用，也有明显的肿瘤抑制作用，在多种肿瘤中表达明显降低，与恶性肿瘤的发生和发展密切相关，被认为是一个候选的抑癌基因。SffiH^ttl(Dendrorhynchus zhejiangensis), ΜΤΜ^ζ ^Π (Nematinea)、 异纽目(Heteronemertea)、纵沟虫科(Lineidae)、枝吻纽虫属(Dendrorhynchus)，最早在浙江省东部奉化市沿海的虾塘中发现，因其独特的分支状的吻系统而得名。纽虫动物具有极强的再生能力，独特的脂肪代谢方式，适应能力，但对它的各方面研究国内外均较少见， 其中关于纽虫中凝溶胶蛋白的抗肿瘤作用和该蛋白的制备纯化方法未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，该凝溶胶蛋白纯度较高，约为85%，具有抗肿瘤活性。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为，包括下述步骤a、RNA提取清洗浙江枝吻纽虫得到浙江枝吻纽虫体壁，将浙江枝吻纽虫体壁速冻于液氮中，研磨成粉，然后用RNAiso plus RNA提取试剂盒(购于Takara公司)提取总RNA，具体方法依照试剂盒说明进行操作体壁组织研磨成粉后，加入RNAiso裂解液，浙江枝吻纽虫体壁与裂解液的重量体积比为1 :20，勻浆，室温下静置5分钟，4°C，12000 rpm/min离心5 分钟，取第一上清液，加入氯仿，第一上清液与氯仿的体积比为5 :1，待溶液充分乳化后，室温下静置5分钟，4°C，12000 rpm/min离心15分钟，取第二上清液，加入异丙醇，第二上清液与异丙醇的体积比为1 :1，室温下静置10分钟，4°C，12000 rpm/min离心10分钟，弃上清， 沉淀用75%乙醇振荡洗涤，4°C，12000 rpm/min离心多少时间，干燥沉淀等得到总RNA ；b、cDNA合成将提取的总RNA用cDNA试剂盒(购于Takara公司)合成cDNA，具体合成方法依该cDNA试剂盒说明操作，然后用下述引物进行PCR扩增，G-R: 5’ -CQGGATCCkl GTCTGGACTT GTAAAA-3，(斜体为及拙H I 的酶切位点)和 G-F -CCCAAGCTH CAAGCCATGA GTGTCTT-3’(斜体为历ii/ III的酶切位点)，引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR扩 ±曾程序为94°C 5 min ；94°C 30 s，58°C 30 s，72°C 1 min ；72°C 10 min, PCR 扩增后，用胶体金回收试剂盒(购自Omega公司)回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，切胶回收得到含纽虫凝溶胶蛋白的目的片段的PCR产物；C酶切目的片段双酶切体系为13 μ 1(约含2 μ gDNA)上述PCR产物，1 μ 1 BaniA I 酶，1 μ 1 Hind ΙΠ酶，2 μ 1 IOXK缓冲液(buffer)，加水补到总体积为20μ 1，37°C作用2 h，用回收试剂盒(购自Omega公司)回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，得到酶切后的目的片段；pEI^Sa ( + )载体的双酶切体系为2 μ 1 (含1 μ g载体DNA) pET28a ( + ) 载体(购自 hvitrogen 公司)，0· 5 μ 1 BawR I 酶，0· 5 μ 1 Hind III酶，1 μ 1 IOXK 缓冲液，加水补到总体积为10μ 1，37°C作用2 h，回收试剂盒(购自Omega公司)回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，得到酶切后的pET28a ( + )表达载体；BanR I、Viz7i/ III和 K buffer均购自NEB公司；d连接转化将上述酶切后的目的片段与酶切后的pET28a( + )表达载体进行连接，具体连接体系为酶切后的目的片段7μ1，酶切后的pET28a ( + )表达载体1μ1，Τ4 DNA Iigase buffer 1μ1，Τ4 DNA ligase 1 μ 1，16°C连接过夜，连接结束后，转化至五coli DH5 α中， 得到含目的片段 _pEI^8a ( + )的五 coli DH5 α 质粒；Τ4 DNA ligase buffer、Τ4 DNA ligase和五coli DH5 α均购于Takara公司；e重组质粒转化将上述含目的片段-pEI^Sa ( + )的五coli DH5 α质粒涂布于含 50μ g/ml卡那霉素的LB培养基上，挑取阳性克隆，进行PCR检测并测序，通过与NCBI (AAB02227、CAB04676、EDV38176、ACM777881、CAA24529、ACD13863)上的序列比对后，提取序列正确的重组质粒重新转化至五coli BL21 (DE3)(购于Takara公司)，得到含目的片 g-pET28a ( + )B. co/i BL21 质粒；f重组蛋白诱导表达将上述含目的片段-pED8a ( + )五coli BL21质粒接种到含 50 μ g/ml卡那霉素的LB培养基(购于上海生工)上，37°C，120 r/min振荡培养至生长对数期为A6tltl=O. 6-0. 8，加入异丙基- β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为1 mmol/ L，37°C诱导4 h，菌液经12000 r/min，离心5 min后，弃上清，菌体沉淀冻存备用；g重组蛋白的分离纯化上述步骤f得到的菌体采用Ni-NTA His. Bind Resin试剂盒 (购于Novagen公司)进行分离纯化，具体操作按照试剂盒说明并进行简单改进3ml菌体沉淀悬浮于200μ1 的Wash Buffer溶液中，该Wash Buffer溶液pH 8.0，含有50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 和 10 mM imidazole (购于 hvitrogen 公司)，在 4°C，400 W, 5-10 min 超声破碎，然后在12000 r/min，离心10 min，取上清加入50 μ 1的Ni-NTA Agarose，用250 μ 1 的Wash Buffer溶液分三次洗涤，洗去非特异性结合的杂蛋白；然后用25 μ 1的Elution Buffer溶液分三次洗脱，得到洗脱液，Elution Buffer溶液pH 8.0，含有50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl和250 mM imidazole，洗脱液装入透析袋中，加入pH7. 5，Tris-HCl浓度为50 mM的透析液，所述洗脱液与所述透析液的体积比为1 :100，在4°C透析过夜亲和，层析，分离纯化，得到重组凝溶胶蛋白。 分离纯化后的重组凝溶胶蛋白通过10%SDS_PAGE检测纯度，并运用超微量仪测定浓度。实验的结果显示通过此种方法制备的重组凝溶胶蛋白具有较好的纯度(约85%)。该重组凝溶胶蛋白作用于人胃癌细胞株MGC803，经MTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．从浙江枝吻纽虫中制备凝溶胶蛋白的方法，其特征在于包括下述步骤：ａ、ＲＮＡ提取：清洗浙江枝吻纽虫得到浙江枝吻纽虫体壁，将浙江枝吻纽虫体壁速冻于液氮中，研磨成粉，然后用ＲＮＡｉｓｏ　ｐｌｕｓ　ＲＮＡ提取试剂盒提取总ＲＮＡ，具体方法依照试剂盒说明进行操作；ｂ、ｃＤＮＡ合成：将提取的总ＲＮＡ用ｃＤＮＡ试剂盒合成ｃＤＮＡ，具体合成方法依该ｃＤＮＡ试剂盒说明操作，然后用下述引物进行ＰＣＲ扩增：ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴ　ＧＴＣＴＧＧＡＣＴＴ　ＧＴＡＡＡＡ和ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴ　ＣＡＡＧＣＣＡＴＧＡ　ＧＴＧＴＣＴＴ；　ＰＣＲ扩增程序为：９４℃　５　ｍｉｎ；９４℃　３０　ｓ，５８℃　３０　ｓ，７２℃　１　ｍｉｎ；７２℃　１０　ｍｉｎ，　ＰＣＲ扩增后，用胶体金回收试剂盒回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，切胶回收得到含纽虫凝溶胶蛋白的目的片段的ＰＣＲ产物；ｃ、酶切：目的片段双酶切体系为：１３　μｌ上述ＰＣＲ产物，１　μｌ　ＢａｍＨⅠ酶，１　μｌ　Ｈｉｎｄ　Ⅲ酶，２　μｌ　１０×Ｋ缓冲液，加水补到总体积为２０μｌ，３７℃作用２　ｈ，用回收试剂盒回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，得到酶切后的目的片段；ｐＥＴ２８ａ（＋）载体的双酶切体系为：２　μｌｐＥＴ２８ａ（＋）载体，０．５　μｌ　ＢａｍＨⅠ酶，０．５　μｌ　Ｈｉｎｄ　Ⅲ酶，１　μｌ　１０×Ｋ　缓冲液，加水补到总体积为１０μｌ，３７℃作用２ｈ，用回收试剂盒回收，具体回收方法依该回收试剂盒说明操作，得到酶切后的ｐＥＴ２８ａ（＋）表达载体；　ｄ、连接转化：将上述酶切后的目的片段与酶切后的ｐＥＴ２８ａ（＋）表达载体进行连接，具体连接体系为：酶切后的目的片段７μｌ，酶切后的ｐＥＴ２８ａ（＋）表达载体１μｌ，Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒ　１μｌ，Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　１μｌ，１６℃连接过夜，连接结束后，转化至Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α中，得到含目的片段－ｐＥＴ２８ａ（＋）的Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α质粒；ｅ、重组质粒转化：将上述含目的片段－ｐＥＴ２８ａ（＋）的Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α质粒涂布于含５０μｇ／ｍｌ　卡那霉素的ＬＢ培养基上，挑取阳性克隆，进行ＰＣＲ检测并测序，序列比对后，提取序列正确的重组质粒重新转化至Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３），得到含目的片段－ｐＥＴ２８ａ（＋）Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１质粒；ｆ、重组蛋白诱导表达：将上述含目的片段－ｐＥＴ２８ａ（＋）Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１质粒接种到含５０μｇ／ｍｌ　卡那霉素的ＬＢ培养基上，３７℃，１２０　ｒ／ｍｉｎ振荡培养至生长对数期为Ａ６００＝０．６－０．８，加入异丙基－β－Ｄ－硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为１　ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃诱导４　ｈ，菌液经１２０００　ｒ／ｍｉｎ，离心５　ｍｉｎ后，弃上清，菌体沉淀冻存备用；ｇ、重组蛋白的分离纯化：将上述步骤ｆ得到的菌体采用Ｎｉ－ＮＴＡ　Ｈｉｓ．　Ｂｉｎｄ　Ｒｅｓｉｎ试剂盒进行分离纯化，具体操作按照试剂盒说明并进行简单改进：３ｍｌ菌体沉淀悬浮于２００μｌ　的Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ溶液中，该Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ溶液ｐＨ　８．０，含有５０　ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，３００　ｍＭ　ＮａＣｌ和　１０　ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，在４℃，４００　Ｗ，５－１０　ｍｉｎ超声破碎，然后在１２０００　ｒ／ｍｉｎ，离心１０　ｍｉｎ，取上清加入５０μｌ　的Ｎｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅ，用２５０μｌ的　ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ溶液分三次洗涤，洗去非特异性结合的杂蛋白；然后用２５μｌ的Ｅｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ溶液分三次洗脱，得到洗脱液，Ｅｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ溶液ｐＨ　８．０，含有５０　ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，　３００　ｍＭ　ＮａＣｌ和２５０　ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，洗脱液装入透析袋中，加入ｐＨ７．５，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ浓度为５０　ｍＭ的透析液，所述洗脱液与所述透析液的体积比为１：１００，在４℃透析过夜亲和，层析，分离纯化，得到重组凝溶胶蛋白。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李晔，陈蕾，苏秀榕，李太武，李振，周君，李成华，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：97