拟穴青蟹阴离子抗菌肽的毕赤酵母表达产物及其制备方法，涉及拟穴青蟹抗菌肽的基因工程表达。构建拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin的重组表达载体；将所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；分离纯化所得的表达产物，获得重组蛋白，即拟穴青蟹阴离子抗菌肽Scygonadin。借助基因工程技术，利用pPIC9K毕赤酵母表达载体，表达出具有抗菌活性的拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin，该重组蛋白具有广谱的抗菌活性，抗菌活性与从雄性拟穴青蟹性腺中直接获得的Scygonadin纯品的抗菌结果相似。Scygonadin的基因工程表达产品将在抗病原微生物新药和动物饲料添加剂中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及拟穴青蟹抗菌肽的基因工程表达，特别涉及拟穴青蟹阴离子抗菌肽 Scygonadin的毕赤酵母表达及其制备方法。
技术介绍
拟穴青蟹，俗称青蟹，隶属于甲壳纲 (Crustacea)、十足目(Decapoda)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)，青蟹属 (kylla)，是我国东南沿海最重要的海洋经济蟹类之一。随着青蟹养殖规模地不断扩大，由细菌、真菌、病毒和寄生虫等因素引起的疾病对蟹类养殖业造成巨大损失。抗菌肽被认为是鱼虾蟹贝等防御系统的主要成分之一，是生物体先天免疫系统的重要组成分。已预见到抗菌肽在海水养殖鱼类、蟹类、贝类等的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗耐药性细菌药物和饲料免疫添加剂。研究、开发与应用抗菌肽，对解决海水养殖生产中面临的细菌耐药性和鱼类饲料中滥用抗生素造成的水产品药物残留和水环境污染等问题具有重要的科学意义和实际应用价值，并且将会取得显著的经济效益。自1996年，第一个6. 5kDa的富含脯氨酸的蟹类抗菌肽从岸蟹(Carcinus maenas)中分离，到目前为止已经在蟹类发现了多种抗菌肽，如Cal 1 inectin,抗脂多 糖因子(ALF) (Imjongjirak C, Amparyup P, Tassanakajon A, Sittipraneed S.Antilipopolysaccharide factor (ALF)of mud crab Scylla paramamosain :molecular cloning, genomic organization and the antimicrobial activity of its synthetic LPS binding domain. Mol Immunol. ,2007,44(12) :3195-3203 ； Imjongjirak C, Amparyup P, Tassanakaj on A. Molecular cloning, genomic organization and antibacterial activity of a second isoform of antilipopolysaccharide factor (ALF) from the mud crab, Scylla paramamosain. Fish Shellfish Immunol., 2011,30(1) :58-66) , Crustin(Brockton V, Smith V J.Crustin expression following bacterial injection and temperature change in the shore crab, Carcinus maenas. Dev Comp Immunol. ,2008,32(9) :1027-1033 ; Sperstad S V, Haug T, Paulsen V, Rode T M, Strandskog G, Solem S T, Styrvold O B, Stensvag K. Characterization of crustins from the hemocytes of the spider crab, Hyas araneus,and the red king crab,Paralithodes camtschaticus. Dev Comp Immunol., 2009,33(4) :583-591 ； Mu C, Zheng P, Zhao J, Wang L, Zhang H, Qiu L, Gai Y, Song L. Molecular characterization and expression of a crustin-like gene from Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis.Dev Comp Immunol. ,2010,34(7) :734-740), Scygonadin(Huang W S,Wang K J,Yang M，Cai J J,Li S J,Wang G Z.Purification and part characterization of a novel antibacterial protein Scygonadin,isolated from the seminal plasma of mud crab Scylla serrata( Forskal, 1775) . Exp. Mar. Biol. Ecol. ,2006,339 :37-42 ； ffang K J,Huang W S,Yang M,Chen H Y,Bo J, Li S J,Wang G Z，A male-specific expression gene，encodes a novel anionic antimicrobial peptide，scygonadin，in Scylla serrata. Mol. Immunol.，2007，44 :1961-1968 ； Xu W F，Qiao K，Huang S P，Peng H，Huang W S，Chen F Y，Zhang N，Wang，G ZiWang K J. The expression pattern of scygonadin during the ontogenesis of Scylla paramamosain predicting its potential role in reproductive immunity. Dev Comp Immunol., 2011，In press)，arasin( Stensvag K，Haug T，Sperstad SV, Rekdal 0，Indrevoll B, Styrvold OB. Arasin l，a proline—arginine—rich antimicrobial peptide isolated from the spider crab，Hyas araneus. DevComp Immunol.，2008，32 (3) :275-285 ； Imjongjirak C，Amparyup P，Tassanakajon A. Twonovel antimicrobial peptides， arasin—likeSp and GRPSp, from the mud crab Scylla paramamosain， exhibit the activity against some crustacean pathogenic bacteria. Fish Shellfish Immunol., 2011,30(2) :706-712)和GRPSp。其中scygonadin基因是甲壳动物中第1个被鉴定为主要在雄性生殖腺中特异性转录表达的阴离子抗菌肽(黄文树.锯缘青蟹一种新的阴离子抗菌肽scygonadin及其基因的分离与鉴定.厦门大学博士学位论文，2006)。本申请人从福建东南本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．拟穴青蟹阴离子抗菌肽Ｓｃｙｇｏｎａｄｉｎ的基因序列为：ｇｇｃｃａｇｇｃａｃ ｔｃａａｃａａａｃｔ ｔａｔｇｃｃｔａａａ ａｔｃｇｔｃａｇｃｇ ｃｃａｔａａｔｔｔａ ｔａｔｇｇｔｃｇｇｇ ６０ｃａａｃｃｃａａｔｇ ｃａｇｇｔｇｔｃａｃ ｔｔｔｔｃｔｇｇｇｃ ｃａｃｃａａｔｇｔｃ ｔｇｇｔｇｇａｇｔｃ ａａｃｇａｇｇｃａａ １２０ｃｃａｇａｃｇｇｇｔ ｔｔｔａｃａｃｃｇｃ ａａａｇａｔｇｔｃｇ ｔｇｔｇｃｔｔｃｃｔ ｇｇａｃｔｃａｔｇａ ｔａａｔｃｃｔａｔｔ１８０ｇｔｔｇｇｇｇａａｇ ｇａａｇａａｇｃｃｇ ｇｇｔｔｇａａｃｔｔ ｇａｇｇｃｇｃｔｔａ ａａｇｇｔｔｃｃａｔ ｃａｃａａａｃｔｔｔ ２４０ｇｔｃｃａｇａｃａｇ ｃａｔｃｃａａｔｔａ ｃａａｇａａｇｔｔｃ ａｃｃａｔａｇａｔｇａｇｇｔｃｇａｇｇａ ｃｔｇｇａｔｔｇｃｔ ３００ｔｃｔｔａｃ ３０６。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王克坚，彭会，曲海东，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92
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