本发明专利技术公开了一种苏云金芽胞杆菌菌株，该菌株的保藏名称为苏云金芽胞杆菌YC-10，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?NO：M2010023。该苏云金芽胞杆菌菌株在形成芽孢时能产生伴胞晶体蛋白其提取方法是将菌株活化后的菌液接入到发酵培养基中，振荡培养待菌体破裂后得到胞晶混合物；然后进行洗涤、缓冲液悬浮，离心取上清，沉淀，溶解，再经离心除杂后透析过夜，透析液中即含有伴胞晶体。上述的苏云金芽胞杆菌菌株或其所产生的伴胞晶体能有效应用于植物线虫病害防治。本发明专利技术的菌株及其应用具有高效、低毒、生态环保、且能有效减少农药残留等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物及其在植物保护
中应用，尤其涉及一种苏云金芽胞杆菌及其伴胞晶体以及相应的提取方法和用途。
技术介绍
植物寄生线虫病是农作物的重要病害之一。全球每年由植物寄生线虫所造成的作物损失超过千亿美元，线虫病害已成为农业生产上的一个突出问题。目前，农业生产上常采用化学杀线虫剂来防治植物寄生线虫病害，但现今市场上杀线虫剂的品种有限，大部分为高毒、高残留农药，长期单一地使用高毒、高残留的化学杀线虫剂，不仅对环境造成了严重的污染，也引发了农产品中农药残留超标、线虫抗药性日益突出等系列环境和社会问题。近年来，随着人们对农产品安全的日益关注，化学农药的使用越来越受到限制，因此，研发有效的杀线虫微生物以补充或替代化学杀线虫剂就显得日益迫切。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上应用最广泛、最成功的微生物杀虫剂，被广泛应用于农业、林业、贮藏以及卫生等领域的害虫防治。自从1961年Ciordia等首次发现Bt对牛肠道蛇形毛圆线虫(thichostrongylus colubriformis)卵和幼虫有杀灭作用以来，Bt的杀线虫作用才逐渐引起人们的关注。国内外已报道的具有杀线虫活性的Bt菌株主要包括Bt苏云金亚种(B.t.subsp. thuringiensis)、以色列亚种(B. t. subsp. Israelensis)、库斯塔克亚种(B. t. subsp. Kurstaki)和莫里斯亚种(B.t.subsp. Morris)。这些菌株对多种植物线虫具有生物活性， 如酸酱线虫(Panagrellus redivivus)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)禾口大豆抱囊线虫(Heterodera glycines)等(Schnepf, 1998)。1985年Bone等首次证实了 Bt伴胞晶体蛋白(δ-内毒素)对线虫的作用活性， 2003年Wei等研究了不同基因产生的伴胞晶体对几种自由生活线虫的毒性，从两个主要的 B. t.晶体蛋白亚家族中表达出了 7种不同的晶体毒素蛋白，通过测试这些晶体毒素蛋白对自由生活的线虫毒性，证实了其中4种晶体毒素蛋白(Cry5B、Cry6A、Cryl4A、Cry21A)对多种线虫种类均有活性，所测试的线虫至少对一种晶体毒素蛋白敏感，从而明确提出Bt晶体毒素蛋白具有杀线虫能力(Wei JZ, 2003) 0 B. t.晶体毒素蛋白是由毒素蛋白基因(cry基因)编码的，不同苏云金芽胞杆菌亚种或菌株所具有的cry基因不同。1988年以来，美国 Mycogen公司分离到一些对秀丽新小杆线虫、短体线虫、捻转血矛线虫等有毒性的苏云金芽胞杆菌，并从这些菌株中克隆了一些杀线虫毒素蛋白基因(参见http://appft.USpt0. gov/netacgi)。到目前为止，全世界从B. t.菌株中已分离到的杀线虫基因主要有cryl、 cry5、cry6、cryl2、cry 13以及cry21几大类，但数量十分有限，而且这些菌株、伴胞晶体蛋白及伴胞晶体蛋白基因几乎都以专利的形式加以保护，所涉及的菌株也多使用代号。因此， 分离鉴定新的苏云金芽胞杆菌杀线虫菌株引起国内外科学家的广泛重视。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种对植物寄生线虫特异、高效的苏云金芽胞杆菌菌株及其伴胞晶体，还提供一种简单、易行的该伴胞晶体的提取方法，同时还提供一种高效、低毒、生态环保、且能有效减少农药残留的前述菌株或伴胞晶体在植物线虫病害防治中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为一种苏云金芽胞杆菌菌株，所述苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株的保藏名称为苏云金芽胞杆菌YC-10，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO =M 2010023，保藏日期2010年1月21日。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种伴胞晶体，该伴胞晶体是上述的苏云金芽胞杆菌菌株在形成芽孢时所产生的(棱形或不规则形)伴胞晶体蛋白。上述菌株的特征主要有a.该菌株发酵液呈碱性，产棱形伴胞晶体；b.组成伴胞晶体的杀线虫晶体蛋白为分子量包括30KDa、55KDa、80KDa等多个组分。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供上述伴胞晶体的提取方法，包括以下步骤 将上述保藏的苏云金芽胞杆菌菌株进行活化后得到的菌液接入到发酵培养基中，在25°C 37°C温度、125r/min 225r/min下振荡培养72h 120h，待所述菌株的菌体破裂后，离心收集培养得到的胞晶混合物；然后分别用食盐水和灭菌水对该胞晶混合物进行洗涤，再用含β-巯基乙醇的缓冲液悬浮，在37°C温度下作用lh(使蛋白质溶解)，再离心取上清，加入乙酸钠溶液并置于冰上沉淀，沉淀后的蛋白用灭菌水洗涤，并用缓冲液溶解，再经离心除杂后将上清液进行透析过夜，所得透析液中即含有分离提纯得到的伴胞晶体。上述的伴胞晶体的提取方法中，所述发酵培养基优选包含以下质量分数的组分 牛肉膏 0. 3% 0. 5%、蛋白胨0. 5% 2. 0%、葡萄糖0. 1% 0. 3%,NaCl 0. 2% 1. 0%、 MgSO4 · 7Η200· 01 % 0. 03 %、K2HPO4O. 005% 0.03% 和 MnSO4O. 003 % 0. 005 %，所述发酵培养基的PH值为5. 5 8. 5。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种上述的苏云金芽胞杆菌菌株或伴胞晶体在植物线虫病害防治中的应用。上述的应用中，可以优选将所述苏云金芽胞杆菌菌株制成发酵滤液后，用于植物线虫病害的防治，该发酵滤液可按以下制备方法制得将所述苏云金芽胞杆菌菌株接种到发酵培养基中，然后在25°C 37°C、125r/min 225r/min条件下震荡培养72h 120h得到发酵液，发酵液再经离心分离后取上清液，即得到发酵滤液。上述的应用中，所述植物线虫优选包括了根结线虫或大豆孢囊线虫。所述根结线虫优选为南方根结线虫J2幼虫及卵。所述大豆孢囊线虫优选为大豆孢囊线虫J2幼虫及卵 (根结线虫、大豆孢囊线虫J2为它们的侵染期虫龄，所以做生测时一般选用该龄期幼虫做试验)。与现有技术相比，本专利技术的优点在于本专利技术从烟草中筛选到了一株对线虫高活性的苏云金芽胞杆菌菌株YC-10，生物活性测定结果显示该菌株的发酵滤液及其所产生的伴胞晶体蛋白对包括南方根结线虫J2幼虫、大豆孢囊线虫J2幼虫等在内的植物线虫都具有较强的生物活性，并能显著抑制南方根结线虫与大豆孢囊线虫卵的孵化。经过我们的测试发现，本菌株的发酵滤液Mh内可使南方根结线虫与大豆孢囊线虫J2全部死亡。同时本专利技术菌株产生的伴胞晶体蛋白对南方根结线虫J224h的LC5tl可达5. 86 μ g -πιΓ1 (LC50为致死中量)，对大豆孢囊线虫J224h的LC5tl可达4. 87μ g · mL—1。而且，本专利技术的菌株及其产物还能显著抑制线虫卵的孵化，对南方根结线虫与大豆孢囊线虫卵的孵化抑制率分别达到71. 7%和62. 1%。总的来说，本专利技术开拓了植物寄生线虫生物防治的新途本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种苏云金芽胞杆菌菌株，其特征在于：所述苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株的保藏名称为苏云金芽胞杆菌ＹＣ－１０，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０１００２３。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：成飞雪，刘勇，张德咏，王忠勇，程菊娥，罗源华，张松柏，何明远，谭新球，朱春晖，罗香文，戴建平，杨春晓，
申请(专利权)人：湖南省植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：43
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