通过敲除（yvoA）基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌的方法属于生物工程技术领域。本方法首先以苏云金芽胞杆菌ATCC35646为出发菌株，以温度敏感型载体pKSV7为骨架构建一个基因敲除载体pKSV-ued，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除苏云金芽胞杆菌ATCC35646菌株基因组yvoA基因的方法，构建了一个高产几丁质酶菌株CJ212。经过几丁质酶活测定，确定改良菌株产几丁质酶的能力大大提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及通过敲除yvoA基因提高苏云金芽胞杆菌几丁质酶产量的方法，属于生物工程
技术介绍
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种革兰氏阳性菌,其在生长周期的稳定期形成的芽胞及伴胞晶体使其独具特性。由于苏云金芽胞杆菌制剂对靶标昆虫有特异性毒杀作用，且对人畜安全、不危害环境，在农业、林业和卫生害虫的防治上得到了广泛应用。许多Bt菌除了合成杀虫晶体蛋白夕卜，也能产生几丁质酶。Bt几丁质酶不仅具有杀虫增效作用，对病原真菌也有抑制作用，具有防治农作物病虫害的作用(Liu D, Cai J, Xie CC, Liu C，Chen YH. Purification and partial characterizationof a 36-kDa chitinase from Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, and itsbiocontrol potential. Enzyme and Microbial Technology, 2010, 46(34): 252 - 256.Xiao L, Xie CC, Cai J, Lin ZJ, Chen YH. Identification and characterization ofa chitinase-produced Bacillus showing significant antifungal activity.Current Microbiology, 2009, 58(5) :528 - 533. ) 此外，由几丁质酶分解产生的几丁寡糖有明显的抗肿瘤作用，可激活巨噬细胞和淋巴细胞，增强机体免疫力，已用于抗癌的临床治疗以及药物及保健食品的开发领域(Khoushab F, Yamabhai M. Chitin researchrevisited. Marine Drugs, 2010, 8(7):1988 - 2012. ；Zhao Y, Park RD, Muzzarelli RAA.Chitin deacetylases!properties and applications. Marine Drugs, 2010, 8(I):24-46.；Zhou Z, Zheng T, Homer R J, Kim Y, Chen N Y, Cohn L, Hamid Q and Elias J A. AcidicMammalian Chitinase in AsthmaticTh2 Inflammation and IL-13Pathway Activation.Science, 2004，304:1678 1682.)。因此几丁质酶在农业、工业、食品、医药等领域展现出良好前景，具有重要的经济价值。但由于Bt菌株几丁质酶产量普遍较低，制约了其在实际生产中的应用。因此，提高Bt几丁质酶产量是几丁质酶开发应用的关键问题之一。目前，国内外提高Bt几丁质酶产量的方法主要是筛选高产菌株，优化发酵条件，而甚少应用分子生物学技术对菌株进行改良来提高其产量。YvoA蛋白(Gene ID: JQ579452)，作为芽孢杆菌中的一种调控蛋白，在N-乙酰葡糖胺的代谢过程中发挥着关键的作用，相关研究表明，YvoA蛋白对几丁质酶的合成具有一定的阻遏作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有Bt菌株几丁质酶产量普遍较低的问题，提供一种及应用。本方法利用分子生物学技术，首先以温度敏感型载体PKSV7为骨架构建一个基因敲除载体pKSV-ued，经过电转化导入苏云金芽胞杆菌ATCC35646菌株中。利用同源重组原理，通过双交换过程敲除苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组yvoA基因，从而构建一种高产几丁质酶的苏云金芽胞杆菌CJ212 (见图I)。本专利技术提供的通过敲除yvoA基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis) CJ212 的方法包括第I、yvoA基因敲除载体pKSV_ued的构建(见图2)第I. I、设计序列表中SEQ ID No. I所示的引物yvoAup-F和SEQ ID No. 2所示的引物yvoAup-R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因上游序列，获得1059bp的yvoAup核酸片断；第I. 2、设计序列表中SEQ ID No. 3所示的引物yvoAdown-F和SEQ ID No. 4所示 的引物yvoAdown-R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因下游序列，获得1033bp的yvoAdown核酸片断；第I. 3、设计序列表中SEQ ID No. 5所示的引物erm_F和SEQ ID No. 6所示的引物erm-R,以pHT315质粒为模版PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得1197bp的erm基因片断。PCR扩增体系如下total DNA5 μLI OxPCR Buffer5 liLMgCl2 (25mM )5‘uLdNTP Mixture ( γ 2.5 mM )2.5 iiL引物 I (10 μΜ)1.0 μ 引物 2 (10μΜ)1.0 μ Taq 酶(5U々L)0.5 μ 无菌CldH2O补足至:50 μ PCR 程序扩增erm基因的程序94°C预变性4min ;94°C变性40s，48°C复性35s，72°C延伸I. lmin，共计30个循环，72°C延伸IOmin0扩增yvoAup序列和yvoAdown序列的程序94°C预变性4min ;94°C变性40s,50°C 47°C复性50s，72°C延伸I. lmin，每个循环降低1°C，循环4次；然后，94°C变性40s，50°C复性50s，72。。延伸I. lmin，循环26次，共计30个循环；72°C延伸IOmin0第I. 4、将第I. 3步获得的erm基因片断和载体pKSV7用SalI和Xba I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-e载体，转化大肠杆菌DH5 α，提质粒，酶切验证正确后于-20°C保存备用；第I. 5、yvoAup核酸片断和载体pKSV-e用SalI和Hind III双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-ue载体，转化大肠杆菌DH5 α，提质粒，酶切验证正确后于_20°C保存备用；第I. 6、将第I. 2步获得的yvoAdown核酸片断和第I. 5步获得的pKSV-ue载体用XbaI和Kpn I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-ued载体，转化大肠杆菌DH5 α，提质粒，酶切验证正确后于-20°C保存备用。第2、CJ 212突变菌株的构建(见图3)以苏云金芽胞杆菌ATCC35646为出发菌制备感受态细胞，采用电转化方法，将第I步获得的yvoA基因敲除载体pKSV-ued转化入苏云金芽胞杆菌ATCC35646，在基因组yvoA位点发生双交换，ERM抗性平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为CJ212 ;该菌株的yvoA基因被红霉素抗性基因所取代，成为缺失了 yvo A基因的突变菌株，即为所得到的菌株。所述敲除yvoA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过敲除yvoA基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌（Bacillus？thuringiensis）的方法，其特征在于该方法包括：第1、yvoA基因敲除载体pKSV？ued的构建第1.1、设计序列表中SEQ？ID？No.1所示的引物yvoAup？F和SEQ？ID？No.2所示的引物yvoAup？R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因上游序列，获得1059bp的yvoAup核酸片断；第1.2、设计序列表中SEQ？ID？No.3所示的引物yvoAdown？F和SEQ？ID？No.4所示的引物yvoAdown？R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因下游序列，获得1033bp的yvoAdown核酸片断；第1.3、设计序列表中SEQ？ID？No.5所示的引物erm？F和SEQ？ID？No.6所示的引物erm？R，以pHT315质粒为模版PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得1197bp的erm基因片断；第1.4、将第1.3步获得的erm基因片断和载体pKSV7用Sal？I和Xba？I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV？e载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于？20℃保存备用；第1.5、yvoAup片断和载体pKSV？e用Sal？I和Hind？III双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV？ue载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于？20℃保存备用；第1.6、将第1.2步获得的yvoAdown片断和第1.5步获得的pKSV？ue载体用Xba？I和Kpn？I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV？ued载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于？20℃保存备用；第2、CJ？212突变菌株的构建以苏云金芽胞杆菌ATCC35646制备感受态细胞，采用电转化方法，将第1步获得的yvoA基因敲除载体pKSV？ued转化入苏云金芽胞杆菌ATCC35646，在基因组yvoA位点发生双交换，红霉素抗性平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为CJ212；该菌株的yvoA基因被红霉素抗性基因所取代，成为缺失了yvoA基因的突变菌株，即为所构建的菌株。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡峻，陈建，李丽娜，石天威，陈月华，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：
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