本发明专利技术属于农业微生物学技术领域。公开了一株高产黑色素的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)突变株BMB181。本发明专利技术以苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171为出发菌进行高温诱导，获得一株在28℃条件下高产黑色素的苏云金芽胞杆菌突变株BMB181(保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?NO：M2011016)，该菌能够作为宿主菌，具有良好的转化性能和表达性能，对紫外具有明显抗性作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业微生物应用
具体地说，本专利技术涉及一株高产黑色素的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)突变株的分离、黑色素鉴定及该突变株作为宿主菌的转化性能和表达性能测定及应用。本专利技术与微生物农药
有关。
技术介绍
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一类广泛存在于土壤中的革兰氏阳性细菌，它的一个显著特点就是能够在芽胞期产生对昆虫具有特异毒杀作用的晶体蛋白(Insecticidal crystal Proteins, ICPs),从而有别于分泌肠毒素的腊状芽胞杆菌(Bacillus cereus)和引起炭疽病的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)。由于苏云金芽胞杆菌对目标生物具有特异、高效、对人畜无毒、不污染环境、不杀伤昆虫天敌等优点，并且 用农副产品作原料易于工业化生产，目前苏云金芽胞杆菌已经成为世界上应用最广泛、最成功的生物杀虫剂(喻子牛，孙明，陈亚华，等.苏云金芽胞杆菌生物活性蛋白基因在动、植物病虫害防治中的应用综述.农业生物技术学报，1995，3 (2) :100-110)。黑色素由各种类型的酚类或吲哚单体组成，通常包含一些蛋白质分子或者掺杂一些碳水化合物分子，在微生物、动物、原生动物以及植物中均可产生。不同生物黑色素之间单体的类型可能存在差异，一些生物物质被划分为黑色素很大程度上依赖于其物理或化学性质(Nicolaus R A, Piatelli M and Fattorusso E. Thestructure of melanins andmelanogenesis-IV. On some natural melanins. Tetrahedron, 1964, 20 :1163-1172)。黑色素具有防止蛋白质降解、光子屏蔽、化学保护等作用，特别是它对紫外线和辐射具有抵抗性。苏云金芽胞杆菌能够形成具有杀虫活性伴胞晶体，作为广泛应用的生物杀虫剂有其自身的缺陷。其一，杀虫晶体蛋白在施用时易受到阳光中紫外线的破坏，影响效果，黑色素成为解决晶体蛋白阳光损害这一问题的有效办法；其二，B. thuringiensis可以形成多种晶体蛋白，但每一种都有其自身特定杀虫范围，人们期待按照需要构建具有特定杀虫活性的重组菌。因此，获得既产黑色素又可按照需要表达各种晶体蛋白的菌株成为解决这一问题的可行办法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，分离筛选高产黑色素的苏云金芽胞杆菌突变株，并将该突变株作为宿主菌的转化性能和表达性能进行测定和应用。本专利技术的技术方案如下申请人:按照高温诱导产黑色素突变株操作流程，以苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171为出发菌株，获得一株在28°C条件下高产黑色素的苏云金芽胞杆菌突变株，申请人将该菌株命名苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki)BMB181 (为了方便叙述，在本说明书中将该菌株简称为苏云金芽胞杆菌BMB181)，苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种 BMB181 (Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki BMB181)于 2011年I月11日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为 CCTCC NO M2011016o本专利技术的突变株苏云金芽胞杆菌BMB181具有下列明显特征(I)本专利技术的突变株苏云金芽胞杆菌BMB181能够大量生产黑色素，该突变株最高产黑色素量比已经报道的苏云金芽胞杆菌产黑色素量均高，而且在没有额外添加底物酪氨酸的情况下仍然产生大量黑色素，并且这种性状可稳定遗传。(2)本专利技术的突变株苏云金芽胞杆菌BMB181能够作为宿主菌，具有良好的转化性能和表达性能。(3)本专利技术的突变株苏云金芽胞杆菌BMB181所产黑色素具有保护晶体蛋白免受紫外线破坏作用。 本专利技术的苏云金芽胞杆菌BMB181的菌学特征如下营养细胞粗短杆状，两端钝圆，周生鞭毛，能运动，通常2 4个连在一起，大多数为两连。个体大小为I. OX (2. 4 4. 4) u m，革兰氏染色阳性，芽胞呈圆柱状或近似椭圆，偏端生，芽胞囊不膨大，在LB固体培养基上菌落边缘不整齐，成粗布状向外展开，略呈放射状；菌苔丰满呈蜡质状，生长温度10_45°C，最适生长温度26-32°C，适宜pH6. 8-7. 4，兼性嫌气，无伴胞晶体生成，产生可溶性黑色素。该菌株按照常规甘油管保藏方法(王婭等，几种简易的菌种保存方法.青岛医药卫生，2009，41 (6) =451-452)保藏。更详细的技术方案参见实施例部分的描述。附图说明序列表SEQ ID NO :1是本专利技术筛选的高产黑色素的苏云金芽胞杆菌突变株BMB181的csab基因(编码多糖丙酮酸转移酶)的部分序列。图I :本专利技术的技术流程图。图2 :不同培养基上本专利技术的突变株苏云金芽胞杆菌BMB181与出发菌株苏云金芽胞杆菌BMB171产黑色素情况比较。图中A :ICPM培养基，上部为出发菌株苏云金芽胞杆菌BMB171，下部为本专利技术分离的苏云金芽胞杆菌BMB181 ；B :LB培养基，上部为苏云金芽胞杆菌BMB171，下部为本专利技术分离的苏云金芽胞杆菌BMB181 ；C :LB+tyr0Sine培养基，上部为苏云金芽胞杆菌BMB171，下部本专利技术分离的苏云金芽胞杆菌BMB181 ；D :发酵培养基，左图为苏云金芽胞杆菌BMB171，右图为本专利技术分离的苏云金芽胞杆菌BMB181。图3 :苏云金芽胞杆菌BMB181黑色素红外谱图。图4:黑色素标准曲线图。图5 LB中苏云金芽胞杆菌BMB171与BMB181生长及产黑色素曲线图；图中生长曲线BMB171 ，BMB181 □;产黑曲线BMB171 ▲, BMB181X。图6 :质粒pHT304(6. 7kb)物理图谱，该质粒带有红霉素和氨苄青霉素抗性基因。图7 :质粒pBMB1251 (IOkb)物理图谱，该质粒带有红霉素、卡那霉素和氨苄青霉素抗性基因，具有温度敏感性复制起点。图8 :质粒pBMB625(17kb)物理图谱，该质粒带有红霉素抗性基因，具有ori60复制起点。图9 :质粒pBMB292 (38kb)物理图谱，该质粒带有红霉素抗性基因，具有ori60复制起点。图10 BMB32晶体光学显微镜图。图 11 BMB32 杀虫晶体蛋白 SDS-PAGE 图。图中M，protein marker ; 1-3，小牛血清白蛋白;4-6，BMB32。图12 :小牛血清白蛋白标准曲线。具体实施方案以下叙述是根据本专利技术实施方案的实施例，详细技术流程参照图I。应当说明的是，本专利技术的实施例对于本专利技术只有说明作用，而没有限制作用。有关DNA的标准操作方法和所使用的药品或试剂均参考J.萨姆布鲁克等著的《分子克隆实验指南》所描述的内容 (参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。本专利技术中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本专利技术申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等等加以实施。实本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株高产黑色素的苏云金芽胞杆菌(Bacillus？thuringiensis)，其特征在于该菌株是苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种BMB181，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCCNO：M2011016。
【技术特征摘要】
1.一株高产黑色素的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis),其特征在于该菌株是苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种BMB181，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏...
【专利技术属性】
技术研发人员：阮丽芳，孙明，刘风侠，杨文君，彭东海，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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