本发明专利技术涉及血液制品领域，特别涉及一种能从冷沉淀制备三种血液制品的工艺方法。其目的在于提供一套完整的分离纯化工艺，能够从冷沉淀中先后分别制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白，共三种血液制品。本发明专利技术通过以下技术方案实现：制备步骤包括：冷沉淀溶解、凝胶吸附、纤维蛋白原和纤维结合蛋白沉淀析出、两步离子交换层析和甘氨酸/氯化钠沉淀法，以及病毒灭活。本发明专利技术有益效果：可以按照先后顺序分别从冷沉淀中分离提取凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白共3种有用的血液制品。大大提高了血浆的利用率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及血液制品领域，特别涉及一种能从冷沉淀制备三种血液制品的工艺方法。
技术介绍
冷沉淀新鲜冰冻血浆低温融化后析出的一种沉淀组分，富含凝血因子通、纤维蛋白原和纤维结合蛋白。血浆中约一半的凝血因子VDI和纤维蛋白原，以及绝大部分的纤维结合蛋白会富集在冷沉淀当中。凝血因子VDI是治疗甲型血友病唯一的特效药，在临床上有巨大的应用价值。纤维蛋白原是治疗先天性和获得性纤维蛋白原缺乏症的首选药物。纤维结合蛋白在治疗疱疹性角膜溃疡方面也有较高的临床价值。目前世界上几乎所有的血浆来源的凝血因子VDI都是从冷沉淀制备得到的；纤维蛋白原多数是由Cohn氏组分I制备得到的，也有少部分是由冷沉淀制备得到的；纤维结合蛋白在临床上则直接由冷沉淀代替。关于冷沉淀制备凝血因子VDI或者纤维蛋白原的报道非常多，而且许多技术方案已经在商业上得到实施。制备纤维结合蛋白的技术方案也非常多，多数为明胶亲和层析。但是由于技术的局限性，还没有任何一种技术方案可以由冷沉淀先后制备凝血因子通、纤维蛋白原和纤维结合蛋白三种血液制品。因为在目前已有的技术方案中，都着眼于一种制品的分离提取和纯化，其他成分都作为杂蛋白被去除，很难再得到利用。在冷沉淀中，凝血因子VDI是一种微量蛋白，而纤维蛋白原和纤维结合蛋白含量要相对丰富的多。因此如果兼顾纤维蛋白原和纤维结合蛋白的收率，那么凝血因子VDI的收率就会很容易受到影响，这也是目前没有任何已报道的工艺可以同时纯化这三种蛋白质制品的原因之一。在现有的血液制品工艺当中，冷沉淀多用于凝血因子VDI的制备，因为凝血因子VDI 是一种更加珍贵、经济价值更高的蛋白质。由于技术的限制，纤维蛋白原和纤维结合蛋白都会被抛弃。在纯化凝血因子VDI的过程中，要通过沉淀技术将含量相对高得多的纤维蛋白原和纤维结合蛋白从溶液中析出，从而提高凝血因子VDI的纯度。常用的沉淀技术有甘氨酸沉淀、PEG沉淀、乙醇沉淀、低pH沉淀等。甘氨酸沉淀法需要消耗大量的甘氨酸，成本较高，而且凝血因子VDI会共沉淀而导致收率降低；PEG沉淀法和乙醇沉淀法存在PEG残留或者蛋白质变性的问题；低PH法会导致纤维蛋白原和纤维结合蛋白沉淀不完全，纯化效果不好。例如专利技术专利(申请公布号101703763A)公开了一种制备纤维蛋白原的方法，利用冷沉淀经过阴离子交换层析法和甘氨酸沉淀法制备纤维蛋白原，无法获得凝血因子VDI和纤维结合蛋白；专利技术专利(专利号03115784. X)公开了一种制备纤维结合蛋白的方法，以冷沉淀为原料经过酒精沉淀、PEG沉淀和阴离子交换层析，制得纤维结合蛋白，但是也无法获得冷沉淀中富含的凝血因子VDI、纤维蛋白原。血浆(特别是人血浆)或者血浆组分是非常宝贵和稀有的资源，只有尽可能的分离纯化出有医疗价值的蛋白质成分，才能提高血浆的有效利用率。这一类的制备技术显然无法使冷沉淀中的各种有用成分得到充分的利用，实现冷沉淀中多种血浆蛋白的综合开发和利用。
技术实现思路
本专利技术提供了一套完整的分离纯化工艺，能够从冷沉淀中先后分别制备凝血因子通、纤维蛋白原和纤维结合蛋白，共三种血液制品。一种由冷沉淀制备凝血因子通、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，制备步骤包括冷沉淀溶解、凝胶吸附、纤维蛋白原和纤维结合蛋白沉淀析出、两步离子交换层析和甘氨酸/氯化钠沉淀法，以及病毒灭活。一种由冷沉淀制备凝血因子通、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，制备步骤包括冷沉淀用注射用水溶解后，在适当的条件下用DEAE Sephadex A50凝胶进行吸附，吸附后的溶液调节至合适的PH、电导率和温度，纤维蛋白原和纤维结合蛋白形成沉淀析出，离心分离沉淀和上清液。上清液经过S/D病毒灭活和离子交换层析纯化得到凝血因子VIL沉淀再溶解后，经过离子交换层析分为流穿液和洗脱液。流穿液经过S/D病毒灭活和2次甘氨酸沉淀得到纯化的纤维蛋白原；洗脱液经过巴氏灭活得到纤维结合蛋白。一种由冷沉淀制备凝血因子通、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，包括以下具体步骤(1)冷沉淀用注射用水在15 35°C范围内搅拌溶解，用0.lmol/L的乙酸调节pH值为 6. 6 7.0，电导率小于4 mS/cm，加入平衡好的DEAE Sephadex A50凝胶，搅拌吸附40 60分钟，离心除去凝胶和未溶解的沉淀；(2)步骤1中离心后的上清液再用0.lmol/L的乙酸调节pH值为6. 2飞.5，并降低温度至12 18°C，纤维蛋白原和纤维结合蛋白会形成沉淀，可以通过离心分离沉淀，而凝血因子 VDI则留在上清液当中；(3)步骤2中离心后的上清液富含凝血因子通，经过澄清过滤后，加入1%的聚山梨酸酯-80和0. 3%的磷酸三丁酯孵育6小时，可以有效灭活潜在的脂包膜病毒，如HBV 等；(4)步骤3中经过病毒灭活的溶液经过弱阴离子交换层析，可以吸附其中的凝血因子通，大部分杂蛋白从层析柱上流穿，吸附后的层析柱经过洗涤可以除去残留的杂蛋白和聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯，用适当的洗脱液可以从层析柱上洗下凝血因子通，经过浓缩、配制、除菌、分装、冻干、100°C /30min干热病毒灭活，即可得到凝血因子VDI制品；(5)步骤2中离心所得的沉淀含纤维蛋白原和纤维结合蛋白，用含氯化钠、枸橼酸钠和盐酸精氨酸的缓冲液溶解后，经过澄清过滤，加入1%的聚山梨酸酯-80和0. 3%的磷酸三丁酯，孵育6小时，可以有效灭活潜在的脂包膜病毒，如HBV等；(6)步骤5中经过病毒灭活的溶液经过弱阴离子交换层析，可以吸附其中的纤维结合蛋白，大部分纤维蛋白原则从层析柱上流穿，吸附后的层析柱经过洗涤可以洗掉少量被吸附的纤维蛋白原和残留的聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯，用适当的洗脱液可以从层析柱上洗下纤维结合蛋白，经过6°C /IOh巴氏灭活后，再经过浓缩、配制、除菌、分装可以制成注射液或者滴眼液；(7)步骤6中层析柱上的流穿液和洗涤液富含纤维蛋白原，向其中加入甘氨酸 (0. 5^1. 5mol/L)和氯化钠(1. (Γ2. lmol/L)，纤维蛋白原形成沉淀，通过离心分离沉淀，将聚山梨酸酯-80、磷酸三丁酯留在上清液当中；(8)将步骤7中所得的纤维蛋白原沉淀溶解后，再加入甘氨酸和氯化钠，再次离心分离沉淀，进一步降低聚山梨酸酯-80和磷酸三丁酯的残留量；(9)步骤8中所得的纤维蛋白原沉淀溶解，经过浓缩、配制、除菌、分装、冻干、 IOO0C /30min干热病毒灭活，即可得到纤维蛋白原制品。以上步骤中所述“离心”是血液制品行业中通用的固液分离技术，一般采用连续流离心机(管式离心机)，转速为通常14000转/分，进液速度通常为广2. 5L/min。所述脂包膜病毒灭活，即通常所说的有机溶剂/去污剂法病毒灭活技术，有机溶剂一般采用磷酸三丁酯，去污剂一般采用聚山梨酸酯-80或者Triton X-100。在孵育6小时，对脂包膜病毒的灭活效果已经得到有效验证。所述“100°C /30min干热病毒灭活”和“巴氏灭活”也是血液制品行业通用的病毒灭活技术，可以有效灭活多种脂包膜和非脂包膜病毒。所述“澄清过滤”是生物制药行业熟知的深层过滤或膜过滤技术。所述“浓缩、配制、除菌、分装、冻干” 都是制药行业熟知的技术或者操作方法。步骤1中所述冷沉淀和注射用水的比例在1:2 1:5之间，以1:3最佳。所述比本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种由冷沉淀制备凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法，其特征在于制备步骤包括：冷沉淀溶解、凝胶吸附、纤维蛋白原和纤维结合蛋白沉淀析出、两步离子交换层析和甘氨酸／氯化钠沉淀法，以及病毒灭活。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：师秀梅，朱孟沼，李斌，菅长永，席智赢，邵玉娟，郑志华，张翠萍，乔福锋，孙永张，谢忠兵，
申请(专利权)人：山东泰邦生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：37
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