细胞培养物中因子Ⅷ多肽滴度的提高制造技术

本发明专利技术涉及一种生产因子Ⅷ多肽的方法，所述方法包括以下步骤：ａ）在用于表达所述因子Ⅷ多肽的条件下培养表达因子Ⅷ多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括包含Ｃ２结构域配体的细胞培养基，和ｂ）通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子Ⅷ多肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及一种生产因子VIII多肽的方法，包括使用C2结构域配体，尤其是O-磷酸-L-丝氨酸(OPLS)。专利技术背景典型的血友病或血友病A是一种遗传性出血疾病。它源于与染色体X有关的血液凝结因子VIII缺陷，并且几乎只影响男性，发病率为每10,000人中1到2例。X染色体缺陷由自身不是血友病患者的女性携带者传播。血友病A的临床表现是出血倾向的增加。在利用因子VIII浓缩物的治疗被引入前，患有严重血友病的人的平均寿命低于20年。使用来自血浆的因子VIII浓缩物显著改善了血友病患者的情况，广泛地增加了平均寿命，使他们中的大多数能够过上或多或少正常的生活。但是，在血浆来源的浓缩物和它们的使用中存在某些问题，其中最严重的问题是病毒的传播。到目前为止，造成AIDS、乙肝和非甲非乙型肝炎的病毒已经严重影响人群。从那时起不同的病毒灭活方法和新的高度纯化的因子VIII浓缩物近来已被开发出来，这也为血浆来源的因子VIII确立了非常高的安全标准。已知因子VIII(FVIII)在哺乳动物细胞中以非常低的水平表达。并且已知在无血清或无蛋白的培养基中因子VIII是不稳定的蛋白。各种物质的添加已经被用于提高因子VIII的稳定性和滴度。WO 9743436公开了添加金属依赖性抑制剂和/或糜蛋白酶的抑制剂。WO 88/08035和WO 87/04187公开了向因子VIII培养基中添加磷脂。还描述了von Willebrand因子(vWF)的共表达。US 20050227913A1公开了OPLS通过结合C2结构域(2303-2332)而作为因子VIII聚集的抑制剂。聚集更少的因子VIII据称免疫原性更低。K.Hansen，M.Kjalke，P.B.Rasmussen，L.Kongerslev，和M.Ezban，Cytotechnol.24(3)，227-234，1997，公开了使用杆菌肽A和磷脂酰丝-->氨酸来阻止培养基中因子VIII的降解。WO 90/02175A1公开了在存在蛋白酶抑制剂以阻止多肽降解的条件下，通过培养真核细胞生产重组多肽的方法。EP 1707634A1公开了相当大量的因子VIII缔合在细胞表面，可以通过用高离子强度的缓冲液清洗将其洗脱。因此，仍然需要改进的生产方法以便提高因子VIII多肽的总产率和/或降低生产成本。专利技术概述本专利技术的第一个方面涉及一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括包含C2结构域配体的细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽。本专利技术的第二个方面涉及一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽，所述合适的方法包括向所述细胞添加C2结构域配体。附图简述图1.因子VIII基因序列(cDNA)(SEQ ID NO.1)。图2A-B：O-磷酸-L-丝氨酸对FVIII生产率和FVIII蛋白比活性的影响。图3A-C.O-磷酸-L-丝氨酸和/或植物蛋白水解物对因子VIII生产细胞的培养基中因子VIII的影响。条件A-D的特性显示于表4。专利技术详述如上所述，本专利技术的第一个方面涉及一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括包含C2结构域配体的细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽。-->本专利技术的第二个方面涉及一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽，所述合适的方法包括向所述细胞添加C2结构域配体。在这两种情况下，C2结构域配体在促进细胞培养基中因子VIII多肽的滴度水平增加方面起着重要作用。不受任何特定理论的束缚，普遍认为细胞培养基中因子VIII多肽滴度水平的增加由C2结构域配体(尤其是O-磷酸-L-丝氨酸(OPLS))引起，所述C2结构域配体单独的或与大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)和/或植物蛋白水解物组合，(i)增加细胞分泌的因子VIII多肽的量，和/或(ii)竞争与细胞结合的因子VIII多肽使其从细胞脱落，和/或(iii)减少因子VIII多肽的降解从而增加上清中存在的功能性因子VIII多肽的量。本专利技术将在下文中更详细的解释。C2结构域配体是一种能够结合或被结合于因子VIII多肽的C2结构域(见下文)的配体。优选的，C2结构域配体应当能够从细胞膜替换(竞争掉(competing off))因子VIII多肽。在当前最优选的实施方案中，C2结构域配体是O-磷酸-L-丝氨酸(OPLS)，即分子式(HO)2P(O)OCH2CH(NH2)CO2H的分子。合适的可选择的C2结构域配体被认为具有分子式(XO)(HO)P(O)OCH2CH(NH2)CO2H，其中X选自任选取代的C1-6-烷基，任选取代的C2-6-链烯基，任选取代的苯基，任选取代的杂芳基，任选取代的杂环基，和任选取代的苯甲基。在其一个实施方案中，X选自任选取代的C1-6-烷基，任选取代的苯甲基，和任选取代的C2-6-链烯基。在当前上下文中，术语“C1-6-烷基”旨在表示具有1到6个碳原子的线性、环状或分枝的烃基，诸如甲基，乙基，丙基，异丙基，戊基，环戊基，己基，环己基。类似地，术语“C2-6-链烯基”旨在表示具有2到6个碳原子并包括至少一个不饱和键的线性、环状或分枝的烃基。链烯基的实例是乙烯基，烯丙基，丁烯基，戊烯基，和己烯基。链烯基的优选实例是乙烯基，烯丙基，丁烯基，尤其是烯丙基。在当前上下文中，即涉及术语“烷基”和“链烯基”时，术语“任选取-->代”旨在表示被讨论的基团可以用选自以下的基团取代一次或数次，优选的1-3次：羟基(当结合不饱和的碳原子时其以互变异构的酮形式存在)，C1-6-烷氧基(即C1-6-烷基-氧)，C2-6-链烯氧基，羧基，氧代(形成酮或醛官能度)，C1-6-烷羰基，甲酰基，芳基，芳氧基，芳氨基，芳羰基，杂芳基，杂芳氧基，杂芳氨基，杂芳羰基，杂环基，杂环氧基，杂环氨基，杂环羰基，氨基，单和双(C1-6-烷基)氨基；氨基甲酰基，单和双(C1-6-烷基)氨羰基，氨基-C1-6-烷基-氨羰基，单和双(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨羰基，C1-6-烷羰基氨基，胍基，脲基，C1-6-烷基-磺酰-氨基，C1-6-烷基-磺酰基，C1-6-烷基-亚磺酰基，C1-6-烷硫基，卤素，其中任意芳基、杂芳基和杂环基可以按照下文对于芳基、杂芳基和杂环基具体所述被取代。术语“卤素”包括氟，氯，溴，和碘。在当前上下文中，术语“芳基”旨在表示完全或部分芳香族碳环或环系统，诸如苯基，萘基，1，2，3，4-四氢化萘，蒽基，phenanthracyl，芘基，苯并芘基，芴基和呫吨基，其中苯基是优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产因子Ⅷ多肽的方法，所述方法包括以下步骤：ａ）在用于表达所述因子Ⅷ多肽的条件下培养表达因子Ⅷ多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括包含Ｃ２结构域配体的细胞培养基，和ｂ）通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子Ⅷ多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-5-4 07107477.71.一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括包含C2结构域配体的细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽。2.一种生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽，所述合适的方法包括向所述细胞添加C2结构域配体。3.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述C2结构域配体是O-磷酸-L-丝氨酸(OPLS)。4.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述C2结构域配体以0.1-100mM的浓度存在于细胞培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：LB约翰森，I希尔登，G博尔特，TD斯蒂恩斯特鲁普，
申请(专利权)人：诺沃诺迪斯克有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]