本发明专利技术公开了一种氧化铈纳米颗粒的制备方法及其抗氧化应用，属生物纳米材料领域。本发明专利技术氧化铈纳米颗粒的制备方法是：向铈盐与醋酸钠的水溶液中加入冰醋酸，并搅拌混匀，这之后将该混合液水热处理5～60h，最后将所得黄色沉淀离心、洗涤并干燥，制得氧化铈纳米颗粒。同时，利用蛋白的亚基解离与重新聚合的性质，通过控制球形蛋白外壳的开合，将上述氧化铈纳米颗粒装填进球形空腔蛋白——apoferritin的空腔中，制得生物相容性纳米抗氧化剂。本发明专利技术不仅可以提高氧化铈纳米颗粒的生物相容性，降低其细胞毒性，还可以显著提高氧化铈纳米颗粒的抗氧化活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物纳米材料。具体的说是氧化铈纳米颗粒的制备方法及其抗氧化应用。
技术介绍
活性氧是指生物体内化学性质活泼、氧化能力很强的一类含氧的高反应活性分子，包括超氧阴离子自由基，羟基自由基，过氧化氢等。外界环境中的诸多因素，如日光曝晒，紫外线，电磁辐射，环境污染，药物滥用，吸烟酗酒以及精神压力过大等都会引起活性氧产生。适量的活性氧是维持生命健康所必需的，然而一旦活性氧过量，将会引起脂质过氧化，蛋白质损伤，DNA链的断裂，并造成老化或与老化相关的退行性疾病如癌症、心血管疾病、白内障、关节炎及巴金森氏症等，从而严重威胁机体的健康。近年来，许多的研究正致力于从自然界丰富的动物、植物中寻找具有强的抗氧化活性的天然成分，并且已发现广泛存在于各种蔬菜、水果、茶或红酒中的多酚及类黄酮可作为抗氧化剂，有效终止自由基链锁反应。然而，这些天然成分的抗氧化作用与各种抗氧化酶相比，存在易消耗，无法再生并循环使用等缺点。当今世界，飞速发展的纳米技术为新型抗氧化剂的研发提供了崭新的思路。到目前为止，包括纳米钼，纳米硒，纳米氧化铈等在内的诸多纳米颗粒均已经被证实具有自由基清除活性。然而纳米材料本身普遍存在的一个问题——生物安全性却不容忽视。铁蛋白(ferritin)是生物体中普遍存在的一种天然的含铁的球形蛋白，该蛋白是由球形蛋白外壳以及壳内的铁的氧化物纳米颗粒这两部分组成的。球形蛋白外壳由24 个亚基组成，其外径为12nm，壳内的球形空腔的直径为8nm。球形蛋白外壳上含有8个亲水通道和6个疏水通道，这些通道可以允许外界环境中小的离子或者分子进入球形空腔内部。去掉了壳内铁核的铁蛋白简称为空腔铁蛋白(apoferritin)，空腔铁蛋白所具有的Snm 的球形空腔结构，作为一种天然的、优越的纳米颗粒合成模板，已经被广泛用于Pd，Ag，Ni， Co, CdS及等小粒径纳米颗粒的制备。
技术实现思路
本发提供了一种氧化铈纳米颗粒的制备方法，其具体步骤包括向铈盐与醋酸钠的水溶液中加入冰醋酸，并搅拌混勻。这之后将该混合液水热处理5 60h。最后将所得黄色沉淀离心、洗涤并干燥，制得氧化铈纳米颗粒。上述步骤中，优选的条件为将2. 74 5. 48g (NH4) 2Ce (NO3) 6以及10 20g CH3COONa溶于50 IOOml去离子水中，然后向该溶液中加入10 50ml冰醋酸，并在室温下搅拌1 证。这之后将该混合液转移至聚四氟乙烯内衬中，用不锈钢水热釜密封后，置于 200 300°C烘箱中加热8 Mh。最后将所得黄色沉淀离心(1000 lOOOOg，10 120min) 并用去离子水及乙醇多次清洗，随后在60°C烘箱中干燥过夜，制得氧化铈纳米颗粒。本专利技术还提供一种生物相容性纳米抗氧化剂的制备方法，其特征在于，将制得的氧化铈纳米颗粒与apoferritin溶液混合，然后加酸缓慢调节溶液的pH至1. 5 3. 5，以使 apoferritin的亚基解离。这之后再向该溶液中缓慢滴加碱溶液，以使溶液的pH值缓慢上升至7. 0 9. 0。经分离纯化后最终得到apoferritin包裹的氧化铈纳米颗粒(以下简称 AFt-CeO2)。将氧化铈纳米颗粒与apoferritin溶液混合，其中，蛋白与铈的摩尔浓度之比为 1 100 1 10000。然后加酸缓慢调节溶液的PH至1. 5 3. 5，并在该pH下持续搅拌 10 120min。这之后再向该溶液中缓慢滴加碱溶液，以使溶液的pH值缓慢上升至7. 0 9. 0，继续在室温下磁力搅拌1 2h。2h后，离心(8000 12500g，4°C 25°C，10 60min)， 并将收集到的上清液经凝胶过滤层析(如kphadex G-25柱层析)纯化，最后将纯化后的 AFt-CeO2溶液冻干浓缩。本专利技术制得的氧化铈纳米颗粒的平均粒径小于8nm，一般为4 5nm。本专利技术制备的蛋白包裹的氧化铈纳米颗粒(以下简称AFt-CeO2)，经自由基检测试剂盒分析得知，其自由基清除活性具有浓度依赖性。随着氧化铈浓度的增加，AFt-CeO2的自由基清除能力越来越强。而且这种纳米颗粒与蛋白复合物的自由基清除能力约为无蛋白包裹的氧化铈纳米颗粒的7倍，甚至高于相同蛋白浓度的天然的自由基清除剂SOD(超氧化物歧化酶)的活性。另外，细胞内的抗氧化实验进一步证实，经apoferritin包裹之后， AFt-CeO2在细胞内的自由基清除活性远远高于无蛋白包裹的氧化铈纳米颗粒。本专利技术制备的蛋白包裹的氧化铈纳米颗粒，不仅可以提高氧化铈的自由基清除活性，而且还使氧化铈的细胞毒性大大降低。当铈的浓度高于250uM时，无蛋白包裹的氧化铈纳米颗粒细胞毒性急剧增加。而对于AFt-CeO2,即使铈的浓度介于250 IOOOuM范围内时， 仍无明显的细胞毒性。本专利技术制备的蛋白包裹的氧化铈纳米颗粒，主要通过笼形蛋白介导的细胞内吞的方式进入细胞，这种进入细胞的方式与天然的ferritin或apoferritin进入细胞的方式类似。而无蛋白包裹的氧化铈纳米则主要以巨胞饮的方式进入细胞。本专利技术具有如下优点1、利用水热法合成了平均粒径约为4. 5nm的氧化铈纳米颗粒。该颗粒形状规则， 粒径均一，分散性好。2、利用亚基解离与聚合的方法将上述氧化铈纳米颗粒装填进apoferritin的球形空腔中。经电子能量损失谱分析证实，最终得到的AFt-CeA中铈的平均价态为+3. 3，这要比无蛋白包裹的氧化铈中铈的价态(+4)低，这种铈的价态的降低将有助于AFt-CeO2W 抗氧化活性的提高。3、制备得到的AFt-CeA在试剂盒实验以及细胞内的自由基清除实验中均表现出非常优越的抗氧化活性。试剂盒实验证实，AFt-CeO2的自由基清除活性约为无蛋白包裹的氧化铈的自由基清除活性的7倍，约为相同蛋白浓度的SOD的活性的3. 5倍。HepG2细胞内的自由基清除实验证实，AFt-CeO2在细胞内的自由基清除活性约为无蛋白包裹的氧化铈的 20倍。4、细胞毒性实验证实，当铈的浓度大于250uM时，无蛋白包裹的氧化铈纳米颗粒已经开始表现出比较强的细胞毒性，然而对于AFt-CeO2这种蛋白与纳米颗粒的复合物，即使在铈的浓度介于250 IOOOuM时，仍无明显的细胞毒性。5、细胞内吞实验进一步证实AFt-CeO2主要通过笼形蛋白介导的细胞内吞途径进入细胞，而无蛋白包裹的氧化铈纳米颗粒则主要以巨胞饮的方式进入细胞。附图说明图1. Apoferritin包裹的氧化铈纳米颗粒的制备路线图；图2.实施例1制备的氧化铈纳米颗粒的透射电镜照片㈧及粒径统计⑶；图3.实施例2制备的蛋白包裹的氧化铈纳米颗粒的低分辨透射电镜照片㈧，高分辨透射电镜照片⑶及EDX (C)；图4.蛋白包裹的氧化铈纳米颗粒与无蛋白包裹的氧化铈纳米颗粒的细胞毒性分析；图5.利用试剂盒检测AFt-CeA的自由基清除能力㈧AFt-CeA清除自由基的浓度依赖曲线。(B)不同物质自由基清除能力的比较。图中4 {即即0作灯^^1，所用4 1以及SOD的蛋白浓度与所用的AFt-CeA中的蛋白浓度相同。而所用( 纳米颗粒的铈浓度与AFt-CeA中的铈的浓度相同；图6. AFt-CeO2在细胞内的自由基清除实验。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种氧化铈纳米颗粒的制备方法，其步骤包括：１）向铈盐与醋酸钠的水溶液中加入冰醋酸，搅拌混匀；２）将上述混合液水热处理５～６０ｈ，得到黄色沉淀物；３）将黄色沉淀物离心、洗涤并干燥，制得氧化铈纳米颗粒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马丁，刘祥友，袁荃，严纯华，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。