一种氯霉素检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种氯霉素检测试剂盒及其制备方法，试剂盒主要包括有包被有氯霉素-卵清蛋白偶联抗原的酶标板、氯霉素单克隆抗体溶液、酶标记物溶液，所述氯霉素单克隆抗体溶液与酶标记物溶液的用量比为1∶2。本试剂盒通过抗原抗体的特异性反应和酶对底物的高效催化作用实现对样本中残留的兽药氯霉素的快速定性、定量检测；可检测的样本包括鱼肉和蜂蜜，可满足食品生产企业从原料到成品的质控要求，也可作为食品安全监督和检测机构的常规筛查手段，还能用于动物和微生物实验中的药理与毒理学研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽药残留检测领域，具体地说，本专利技术涉及。
技术介绍
氯霉素(CAP)是一种广谱抗生素，因其售价低、效价高，曾经在我国畜牧业和水产养殖业中得到广泛应用，并成为畜禽及水产品疾病防治的重要药物。随着氯霉素的广泛应用和研究，人们发现其会引起毒副作用，尤其对人体造血系统的毒性极大。1950年发现其可造成严重致死性再生不良性贫血。2002年农业部发布第193号公告将氯霉素及其盐、酯列入食品动物禁用药名单，并且规定氯霉素作为出口肉制品的必检指标。目前检测氯霉素的方法主要有微生物法是氯霉素检测最常用的方法，该方法又可分为棉签法(STOP)、杯碟法 (CPM)、纸片法、琼脂扩散法等。微生物法优点在于简单、快速，在大规模的定性筛选工作中具有一定的应用价值。但其也存在灵敏度低、易受干扰、易漏检、结果易出现假阳性、检出限较高等缺点。气相色谱法(GC):可以对于分配系数相差很近的组分进行分离，从而分离出极为复杂的混合物。有许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器供选用，如氢焰离子化检测器 (FID)、电子捕获检测器(ECD)、氮磷检测器(NPD)等，检出限一般为ppb级。气相色谱法具有分离效能高、选择性强、灵敏度高、检出限低等优点，但是由于受到氯霉素挥发性和热稳定性的限制，样品前处理过程复杂、分析速度慢、仪器化程度高且价格昂贵，气相色谱法在基层推广使用还是比较困难的。氯霉素残留检测色谱-质谱联用技术主要为液质联用仪(LC-MQ和气质联用仪 (GC-MS)。LC-MS现在已进入实用阶段，其灵敏度较荧光检测器高1个数量级，能方便地对 ng/kg级的药物残留组分进行分析检测与结构确认，LC-MS法目前也是美国FDA推荐使用的氯霉素确证方法。但是仪器分析方法因为需要贵重仪器，操作复杂，检测成本高的原因一般在科研和检测机构使用。酶联免疫吸附试验(ELISA)氯霉素的ELISA法检测现已开发出商业试剂盒，但是目前大多数试剂盒检测过程需2 池。ELISA法检测原理是将氯霉素标准品或样品、酶标物加入微孔，温浴时，游离的和酶标记的氯霉素竞争结合氯霉素抗体的结合位点。所有的未反应的酶标物，在清洗步骤中被清除，结合了的酶可以由显色剂显色出来(酶可以使无色的显色剂转变为蓝色)，反应终止液的加入可以使蓝色变成黄色。吸收值在450nm处进行测定。颜色变化的程度反映样品中氯霉素的含量。酶联免疫法的缺点在于影响因素较多，其中包被抗原CAP-0VA、抗CAP单克隆抗体的选择和使用对产品质量影响重大，并且抗原抗体的配对使用极其重要，其制备和筛选与试剂盒性能密切相关，易出现假阳性结果，抗体批次不同，测定结果也会出现差异等，但该法作为一种快速筛选手段，在现场监控和大规模筛选检测中有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种成本低廉、操作简便、灵敏性高的氯霉素检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采取了以下技术方案一种氯霉素检测试剂盒，主要包括有(1)包被有氯霉素-卵清蛋白偶联抗原的酶标板，所述酶标板的每个微孔内氯霉素-卵清蛋白偶联抗原的浓度为ι μ g/ml 3 μ g/ml ；(2)氯霉素单克隆抗体溶液，所述氯霉素单克隆抗体的工作浓度为0. 02 μ g/ml 0.2 μ g/ml ；(3)酶标记物溶液，所述酶标记物为辣根过氧化酶蛋白保护剂标记的羊抗鼠IgG， 所述酶标记物溶液的工作浓度为0. 5 μ g/ml 1 μ g/ml ；所述氯霉素单克隆抗体溶液与酶标记物溶液的用量比为1 2。优选地，每个微孔内氯霉素-卵清蛋白偶联抗原的浓度为2 μ g/ml ；所述氯霉素单克隆抗体的工作浓度为0. 05 μ g/ml 0. 1 μ g/ml ；所述酶标记物溶液的工作浓度为 0. 5 μ g/ml 0· 8 μ g/ml。本专利技术的目的还在于提供上述氯霉素检测试剂盒的制备方法，采取了以下技术方案一种氯霉素检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤(1)制备包被氯霉素-卵清蛋白偶联抗原的酶标板将氯霉素和卵清蛋白采用活化酯法进行偶联得到氯霉素-卵清蛋白偶联抗原，所述氯霉素-卵清蛋白偶联抗原的浓度为6 8mg/ml ；用0. 05mol/L、pH9. 6的碳酸盐缓冲液将所述氯霉素-卵清蛋白偶联抗原稀释后，每孔加入100 μ 1包被酶标板，4°C过夜，洗涤缓冲液洗板，每孔加200 300 μ 1封闭液于37°C封闭，封闭池后甩出封闭液，拍干；将已包被了 CAP-OVA偶联抗原的酶标板晾干，即得，所述酶标板的每个微孔内氯霉素-卵清蛋白偶联抗原的浓度为1 μ g/ml 3 μ g/ml ；(2)制备氯霉素单克隆抗体溶液制备纯度在90%以上、浓度为10mg/ml 20mg/ml的氯霉素单克隆抗体，用0. 2% BSA-PBST将所述氯霉素单克隆抗体稀释；所述氯霉素单克隆抗体的工作浓度为0. 02 μ g/ ml 0. 2 μ g/ml ；(3)制备酶标记物溶液制备辣根过氧化酶蛋白保护剂标记的羊抗鼠IgG，用脱脂奶粉-PBST将所述辣根过氧化酶蛋白保护剂标记的羊抗鼠IgG稀释，所述酶标记物溶液的工作浓度为0. 5μ g/ ml 1 μ g/ml ο所述氯霉素单克隆抗体的制备方法为取8-10周大小Balb/c小鼠作为免疫动物， 以氯霉素-牛血清白蛋白偶联物为免疫原，将氯霉素-牛血清白蛋白偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，100 μ g/只的剂量对小鼠皮下注射，以后每隔两周加强免疫一次，改用弗氏不完全佐剂，腹腔注射；融合前三天强化免疫一次，不用佐剂，但是剂量改为200 μ g/只； 细胞融合按照常规方法操作，当融合后的细胞生长到培养孔面积的四分之一时，取细胞培养上清间接ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，选择阳性强，细胞生长旺盛的细胞，用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存并进行鉴定；单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0. 5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞5-106个 /只，7-10天后采集腹水，经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，即得。缓冲液:PBS(0.IM ρΗ7· 6,0. 15Μ NaCl) ；BSA 的浓度为 15mg/ml。所述辣根过氧化酶蛋白保护剂标记的羊抗鼠IgG的制备方法为为常规方法制备，以小鼠IgG作为免疫原，制备羊抗血清，抗体经亲和层析方法进行纯化，去除羊抗血清中其他非特异蛋白，获得仅识别小鼠IgG、IgM、IgA的高亲合力抗体。羊抗鼠IgG采用常规方法进行辣根过氧化酶蛋白保护剂标记，为了减低与其他物种血清蛋白的交叉反应性，需进行进一步纯化。本试剂盒的原理是采用间接竞争ELISA法检测肉类(牛肉、猪肉、鸡肉)、水产(鱼肉、虾肉)、奶类(固态、液态)、蜂蜜、家禽蛋等样本中的氯霉素。试剂盒酶标板微孔内包被有氯霉素-卵清蛋白的偶联抗原，加入样本或标准液后，样本或标准液中的氯霉素和微孔内包被的偶联抗原竞争结合抗体溶液，加入酶标记物溶液后，用TMB底物显色，样本和标准液中的氯霉素含量与吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出氯霉素含量。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果本试剂盒通过抗原抗体的特异性反应和酶对底物的高效催化作用实现对样本中残留的兽药氯霉素(CAP)的快速定性、定本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种氯霉素检测试剂盒，其特征在于，主要包括有：（１）包被有氯霉素－卵清蛋白偶联抗原的酶标板，所述酶标板的每个微孔内氯霉素－卵清蛋白偶联抗原的浓度为１～３μｇ／ｍｌ；（２）氯霉素单克隆抗体溶液，所述氯霉素单克隆抗体的工作浓度为０．０２～０．２μｇ／ｍｌ；（３）酶标记物溶液，所述酶标记物为辣根过氧化酶蛋白保护剂标记的羊抗鼠ＩｇＧ，所述酶标记物溶液的工作浓度为０．５～１μｇ／ｍｌ；所述氯霉素单克隆抗体溶液与酶标记物溶液的用量比为１∶２。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐海波，王继华，
申请(专利权)人：广州万孚生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81