重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法技术

本发明专利技术公开一种重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，将编码甲醛脱氢酶及甲醛氧化物歧化酶的重组质粒分别转化含分子伴侣共表达质粒的表达菌株，使蛋白酶与分子伴侣共表达，获得了蛋白酶的可溶重组表达(含组氨酸标签或不含组氨酸标签)。本发明专利技术将甲醛脱氢酶及甲醛氧化物歧化酶与组氨酸标签融合表达，可溶重组蛋白，经组氨酸标签亲和纯化可获得蛋白纯度大于90％，平均收获1克菌体能够纯化获得约1毫克的蛋白酶。本发明专利技术在组氨酸标签与蛋白酶之间引入肠激酶酶切序列，可有效酶切去除标签，无载体氨基酸残留。该方法可促进蛋白酶在大肠杆菌表达体系中的可溶表达，并能够高效纯化制备大量重组蛋白酶。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组蛋白表达方法，具体涉及一种。
技术介绍
甲ISI^fiSI (Glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase)(基因 fdhA)来自 Pseudomonas putida 禾口 Pseudomonas aeruginosa 这两个种属的蛋白酶有 86% 的氨基酸序列相同。其性质与III型醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase, ADH)相似。文献中关于此类醛脱氢酶的重组表达资料非常有限，在(Biochemistry 39，10720-10729， 2000)报道中，采用pKK223-3(Tacpromoter，即Tac启动子)表达载体及大肠杆菌TGl表达菌株获得了来自Pseudomonas putida的醛脱氢酶的可溶表达。经Mimetic Blue-2 affinitycolumn(利用此类醛脱氢酶与NAD+的结合性质)及Q-kpharose column色谱纯化，重组蛋白达到90%纯度，收率为140mg/20L发酵液。来自I^seudomonasaeruginosa的醛脱氢酶的重组表达未见文献报本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：（１）基因合成蛋白酶的核苷酸序列，获得目的基因；所述蛋白酶为甲醛脱氢酶和甲醛氧化物歧化酶；（２）表达载体构建：将经基因合成获得的目的基因序列，以ＮｄｅＩ和ＨｉｎｄＩＩＩ酶切位点克隆到以相同的两个酶双酶切的ｐＣｏｌｄ载体中；（３）重组蛋白酶在含分子伴侣共表达质粒的大肠杆菌ｐＧ－Ｔｆ２表达菌株中的表达：转化表达载体到大肠杆菌ｐＧ－Ｔｆ２，并进行诱导表达重组蛋白酶；（４）重组蛋白酶的纯化。

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)基因合成蛋白酶的核苷酸序列，获得目的基因；所述蛋白酶为甲醛脱氢酶和甲醛氧化物歧化酶；(2)表达载体构建将经基因合成获得的目的基因序列，以NdeI和HindIII酶切位点克隆到以相同的两个酶双酶切的PCold载体中；(3)重组蛋白酶在含分子伴侣共表达质粒的大肠杆菌pG-Tf2表达菌株中的表达转化表达载体到大肠杆菌PG-Tf2，并进行诱导表达重组蛋白酶；(4)重组蛋白酶的纯化。2.如权利要求1所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，步骤(1)具体为甲醛脱氢酶和甲醛氧化物歧化酶的氨基酸序列经由Uniprot蛋白质数据库获得，分别为=SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5所示氨基酸序列，对该氨基酸序列进行反向转录获得基因核苷酸序列，分别为SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6所示核苷酸序列，对核苷酸序列做大肠杆菌偏好的密码子优化，基因合成经密码子优化的基因序列，测序正确，获得目的基因。3.如权利要求1所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述pCold载体含有cspA冷激启动子；所述pCold载体为pColdll载体或pColdV 载体。4.如权利要求1所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，步骤C3)具体为重组表达质粒转化大肠杆菌pG-Tf2 ；阳性转化子的表达筛选；培养大肠杆菌及IPTG诱导重组蛋白的表达；SDS-PAGE检测蛋白酶的表达情况及其可溶性。5.如权利要求1或4所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于， 步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：冉晓园，闫敏，刘程，王爽，
申请(专利权)人：上海近岸科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31