本发明专利技术为同种骨移植材料制备中脂肪萃取和蛋白浸提工艺及质量监控，本发明专利技术的特点是：（１）根据免疫原物质的特点分别采取不同的工艺处理。（２）脱脂法是用无毒的水溶剂法代替了有毒的脂溶剂法。（３）每完成一步，均有监控的办法和指标。本发明专利技术解决技术关键：１．工艺步骤设立监控：１）冷水冲洗，不采用较强压力热水（５０℃）和较长时间冲洗骨组织表面。２）冷水浸泡，有利于红细胞膜的破裂，血红蛋白的浸提，用比色法监控。３）脱脂采用水溶剂萃取法，监控用偏光显微镜观察是否脂残留。４）测定超声波清洗液蛋白含量阴性，以保证产品质量。２．脂类物质的去除：用水溶剂代替脂溶剂，并用偏光显微镜监控。
【技术实现步骤摘要】
我国早至上世纪60年代开始同种骨移植，但是由于缺乏现代骨库的技术、设备与质量管理，得不到 合格的骨材料，因此很多病例因感染或排斥而失败。1986年开始在亚太地区建立组织库协作组，促进了同 种骨辐照灭菌技术的普及，杜绝来源于骨移植材料的任何疾病的传播。中国从1986年一开始就参加了这 一协作组，同种骨制备技术与骨库在我国各地推广和建立，1995年和2001年在太原举办全国性有关骨移 植的会议，促进了同种骨移植与骨库的发展，但与国外先进国家相比我国还有很大的差距。其原因是对同 种骨的移植知识有待普及、大段骨移植的技术有待提高，骨库质量管理工作有待改进，同种骨免疫排斥问 题有待继续研究。(李宝兴，中国骨肿瘤骨病，7 (6): 329， 2003)。深冻、冻干和辐照成为当代骨库的基 本制备工艺。辐照不但因其具有高效穿透与灭菌能力，实现包装后灭菌，而且还有助于降低同种骨的免疫 原性。同种骨移植材料在制作工艺上主要是去除免疫原性物质和灭菌。1、同种骨移植材料的免疫原性及去除1) 基本过程新鲜同种异体骨移植后，通过辅助细胞对抗原的摄取、处理和提呈，导致了T细胞和 B细胞活化、增殖和分化，最终产生细胞免疫和体液免疫。新鲜同种异体骨在移后，免疫排斥现象主要 在移植骨区。2) 骨骼中的矿物质不具有抗原性，胶原和非胶原蛋白仅是弱抗原。同种异体骨移植的抗原刺激主要 来自其细胞膜表面组织相容性抗原(MHC),新鲜同种异体骨含有较多的存活细胞(骨细胞，哈氏管和骨 小管的内皮细胞和骨髓内的各种造血细胞)，脂细胞和脂类也是抗原性物质，这些存活的细胞可以直接的 呈递抗原，其免疫致敏可以通过直接途径来实现。因此，新鲜同种异体骨移植诱发宿主产生强烈的免疫 排斥反应。3) 选择物理或化学方法使异体骨细胞失活，即尽量去除或杀死移植骨内的细胞成分，促使细胞表面蛋 白成分分解，就可以达到消除或减弱抗原性的目的。因此，彻底刮除移植骨的骨髓、骨膜、反复洗涤， 是最简单有效的去除部分抗原的方法，从而减弱异体骨移植引起的免疫排斥反应。冷冻和冻干处理可杀 死残存的活细胞，冻干还使抗原结构发生物理变化，深低温冷冻和冻干可进一步减弱同种异体骨的抗原 性。通过化学药剂处理，如用甲醇氯仿(1: 1)除脂，可去除抗原蛋白。有文献报道，骨移植物前期处理包括刮除骨髓和用热水(50°C)反复洗涤。另有报道，用1: 1的氯 仿、甲醇对移植材料脱脂，其目的在于溶解细胞膜进一步减弱移植物的抗原性。但有文献报道，甲醇氯 仿长时间脱脂，成骨能力、钙含量和碱性磷酸酶活性均比不脱脂者明显下降。 2、工艺现部分骨库制备同种骨移植材料的常用方法是深低温冷冻(深冻)，冲洗、甲醇氯仿脱脂，超声清洗， 冷冻干燥(冻干)，然后进行辐照灭菌，使产品达到安全与有效两个目的。二
技术介绍
本课题组从96年开始研究用动物组织，制成脱细胞胶原框架。(王由、李永岚等在2001年申请专 利(专利申请号01131437. 0证书号)。我们是从19%年开始进行用动物组织代替人体组织的研究。1996 2002年建立方法和动物实验， 同时发表5篇文章。在2001年申请个人专利(软硬种组织充填剂)。2003年1月建立实验室，2003年5 月至2005年完成了异种骨实验及活性异种骨移植材料的制作工艺。2004 2007年1月完成了同种骨移植 材料的研制工作(生产工艺的确定、生产工艺的监控，将使用有毒的脂溶剂法改为无毒的水溶剂法除脂的 研究等。三
技术实现思路
(一) 本专利技术的目的1、 在实验的基础上用科学论证法确定同种骨的脂肪萃取——水溶剂萃取方法，并在偏光显微镜下监控；2、 在实验的基础上用科学论证法确定同种骨的蛋白浸提工艺，并对其生产工艺进行实时监控。(二) 本专利技术实现步骤1、 确定同种骨的生产工艺1) 红细胞和血红蛋白的去除一用冷水低渗浸泡法红细胞在低渗(冷水)的条件下红细胞膜破裂，血红蛋白溢出。由于血红蛋白是水溶性物质，用比色 法检查浸出液中有否血红蛋白的残留，进而确定去血是否完全、彻底。2) 免疫原性物质的去除及清洗法(1) 同种骨经深低温冷冻(《-70°C)， 30天以上，以消除大部分细胞免疫原性物质；(2) 用浸泡和清洗，以除细胞膜、蛋白及其他免疫原性物质；(3) 脂类去除本专利用水溶剂萃取法去除脂类。同种骨组织内网状结构中充满了骨髓组织细胞和脂 类，这是具有很强的免疫原性物质。由于脂类含量较多，再加上骨组织框架很硬，不能用加压法挤出脂类。目前通用的去脂法在工艺最初步骤就用较强压力热水(50°C)、较长时间冲洗骨组织表面，以除去 脂类。由于松质骨网眼深部的脂类难以清洗干净，所以还采用较长时间、多次和大量有机溶剂反复浸脂(氯 仿、甲醇)。有机溶剂浸脂去脂很彻底，但骨陷窝和骨小管中会残留有毒的有机溶剂，因此这是工艺上的 难点。 一般的做法是将这些去脂的骨组织暴露在空气中经一周的挥发，这种操作工艺不但对环境污染，对 操作人员也有毒害作用，并且骨组织还会残留有一定量有机溶剂。本产品工艺采用水溶剂萃取法将脂排出网眼。其机理是人体脂在常温下呈固态，在温度升时变为液 态。利用液固态转变的原理，用水溶剂的萃取的办法使脂由髓腔、小梁间隙溢出，并漂浮在水溶液内。骨 条内脂类是否除尽，在偏光显微镜下进行监控。2、 监控关键点1) 多次冷水浸泡；用红细胞的比色检测法检査至阴性。2) 脱脂；偏光显微镜观察切片，有否脂残留。3) 超声波清洗；最后一次清洗液蛋白含量阴性。(三) 本专利技术解决技术关键——工艺步骤设立监控1、 冷水冲洗，不采用较强压力热水枪(50°C)和较长时间冲洗骨组织表面，以防蛋白变性，降低骨组织 机械强度。2、 冷水浸泡，有利于红细胞膜的破裂，血红蛋白的浸出，用比色法监控。3、 脱脂采用水溶剂萃取法，用偏光显微镜观察监控是否有脂残留。4、 测定超声波清洗液蛋白含量阴性，这可以保证产品质量。四具体实施例方式实施例一 血细胞和血红蛋白的去除——用冷水低渗浸泡法冷水低渗除红细胞和血红蛋白。将同种骨切割成所要求形状，浸入冷水中，5天去血细胞。清除法是用冷水浸泡，用比色法测水溶液内已无血红蛋白时，该工艺程序完成。除血红蛋白的方法原理 是骨内含红细胞浸在低渗的水中，红细胞膜很容易破裂，血红蛋白溢入水中。如处置不当，血红蛋白就会 残留在骨板内。骨材料浸入不同溶剂(水、脂)，三天后用偏光显微镜观査结果三天 骨材料浸入水中脂溶剂浸骨材料脂溶剂浸骨材料后浸入水中偏光显微镜观察骨板和小梁间隙和腔内骨板和小梁间隙和腔内同脂溶剂浸骨材料，骨板和无血红蛋白和红细胞大量血红蛋白和红细胞，小梁网腔内大量血红蛋经多次换水在水中已无在脂溶剂内无血红蛋白白和红细胞，血红蛋白在水中无血红蛋白五、结论1、在骨条的制作工艺上，第一步是除血细胞和血红蛋白。①除血细胞和血红蛋白必须用冷水(水温〈2(^C)浸提。② 如果先用热水或脂溶剂去脂,血细胞和血红蛋白的蛋白质被固定,即使再放入水中，也不能使 红细胞膜破裂和血红蛋白浸出。③ 用比色法监控除血细胞和血红蛋白是否完全。2、 在除脂工艺上用水溶剂萃取法代替脂溶剂(甲醇氯仿)浸提法，并提出专利保密性保护。① 水溶剂萃取法是物理法，对环境无污染、对操作者无毒害作用、产品内无有毒物质残留。② 用偏光显微镜监控去本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同种骨移植材料制备中脂肪萃取和蛋白浸提工艺及质量监控专利保护权利。
【技术特征摘要】
1、一种同种骨移植材料制备中脂肪萃取和蛋白浸提工艺及质量监控专利保护权利。2、 一种同种骨移植材料制备中脂肪萃取和蛋白浸提工艺及质量监控其特征1) 同种骨移植材料制备中脂肪萃取和蛋白浸提工艺(1) 同种骨原料在《-7(TC冰箱中存放30天以上；(2) 1 50次冷水浸泡；(3) 用水溶剂萃取。温差在10 80'C，起始温度在0 90'C，终了温度在10 10(TC， 反复1 50次；(4) 超声波清洗次数1 30次，时间20 99分钟。2) 质量监控(1) 第2、 1)制作工艺中(2)和(4)步，均采用比色法测定(2)和(4)浸出液中 的红细胞和蛋白成阴性为止。...
【专利技术属性】
技术研发人员：王由，李永岚，王维民，
申请(专利权)人：王由，李永岚，王维民，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。