本发明专利技术提供了一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒，用于兔粘液瘤病毒的诊断和检测。该试剂盒是根据兔粘液瘤病毒M150R基因序列设计特异性引物、建立了PCR检测方法、优化了PCR反应条件而研制出来的，本发明专利技术还提供了使用该试剂盒的检测兔粘液瘤病毒的方法。本发明专利技术的PCR检测试剂盒可以快速准确地检测兔粘液瘤病毒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兔粘液瘤病毒诊断和检测
，更具体的说，涉及一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒及检测方法。该方法灵敏、特异、快速检测。
技术介绍
兔粘液瘤病毒(Myxomavirus)，属于痘病毒科(Poxviridae)、兔痘病毒属 (Leporipox virus)的成员。病毒粒子呈砖形，大小约为280 230nmX 75nm，由兔粘液瘤病毒可引起兔的一种高度接触性、致死性传染病。该病以全身皮下特别是颜面部和天然孔周围皮下发生粘液瘤性肿胀为主要特征。本病最早于1898年在乌拉圭的蒙得维亚发现，随后不久该病即传播到南美的巴西、阿根廷、哥伦比亚和巴拿马等国家。1930年，此病经墨西哥传入美国加利福尼亚洲，目前在美国西部各州呈地方性流行。澳大利亚为消灭野兔所造成的危害，1950年人为地将粘液瘤病毒引入。1952年本病传入欧洲，18个月内传遍了法国、 比利时、德国和荷兰等国，并越过英吉利海峡传到英伦三岛，同时斯堪的纳维亚和北非国家也发生流行。到目前为止，已有至少56个国家和地区发生过本病。我国目前尚未发现本病， 但近几年实验研究证明，中国家兔对兔粘液瘤病毒的发病率和死亡率均为100%，世界动物卫生组织和我国分别将之列为法定报告的疫病或二类动物传染疫病。兔是本病的唯一易感动物，人和其他动物不易感；各种年龄的兔均易感，但幼兔似乎比成年兔更有抵抗力。本病呈季节性发生，夏秋季为发病高峰季节，每8 10年流行一次，主要流行于大洋洲、美洲、欧洲诸国，在我国尚未见报道。本病主要是机械性传播，即经吸血节肢动物包括各种蚊子、跳蚤、蚋蝇、蜱、兔蚤和螨等的口器携带病毒而传播。兔接触或与被污染的饲料、饮水和器具等接触能引起感染，但接触传播不是主要的传播方式。蚊子是本病的主要传播媒介，但在不同地区传播媒介略有差异。根据临床特征、病理变化，结合流行病学可做出初步诊断。确诊需进行实验室检验。取病变组织作切片或涂片检查星状细胞和包涵体，或取新鲜病料接种家兔、鸡胚、兔肾原代细胞或RK13传代细胞分离病毒，用免疫荧光试验、中和试验和琼脂扩散试验进行病毒的鉴定。随着对国外各种种兔及兔产品原料等的引入，该病对我国养兔业的潜在威胁很大，如果传入，所造成的危害和经济损失将无法估量。尤其近年来，非典型性粘液瘤病毒的出现，往往与纤维瘤病毒产生的临床症状相似，对检测技术提出了更高的要求，所以迫切需要解决具有快速、准确的基因诊断技术。目前报道的诊断方法有病理切片、病毒分离、免疫荧光、中和试验等都费时、费力，用于出入境检验检疫不太现实，而且由于进行活毒操作，对实验室生物安全要求极高，采用PCR方法检测标本中的兔粘液瘤病毒的核酸，灵敏度高，快速仅需几小时既可得到结果，特别适合出入境检验检疫检验工作需要。本专利技术就是在常规 PCR方法的基础上研制的能快速、高灵敏地检测兔粘液瘤病毒的试剂盒及检测方法
技术实现思路
(一)要解决的技术问题本专利技术的目的旨在提供一种兔粘液瘤病毒的PCR检测试剂盒，用于兔粘液瘤病毒的检测和分子流行病学调查。(二)技术方案兔粘液瘤病毒的M150R基因是一段保守的特异的序列，通过对GenBank发布的兔粘液瘤病毒M150R基因序列的比较，自行设计了一对特异的引物，研制了 PCR检测试剂盒以及提供一种使用该试剂盒快速检测样品中兔粘液瘤病毒的方法，以实现对兔粘液瘤病毒的快速、准确地检测。其中所述兔粘液瘤病毒的PCR检测试剂盒，包括 (I)DNA裂解液IOOmM 的 Nacl, pH 8. 0 的 IOmM 的 Tris-HCl, pH 8. 0 的 25mM 的 EDTA,按重量体积比含量为1%的SDS和4 μ g/ μ L的蛋白酶K的混合溶液。(2) PCR 反应液终浓度各50 400 μ M的4中dNTPs,终浓度为0. 1-0. 5 μ M的引物M150R-1和M150R-2， 1.5 — 5. OyM^Mg2+O(3)阳性对照兔粘液瘤病M150R基因的阳性质粒pTM150R。(4) Taq酶按每个PCR反应含1. OU加入，反应液中不含Taq酶；此外，本专利技术的试剂盒里还可以含有3mol/L NaAC、酚、酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇、Taq酶5U/yL、琼脂糖、溴化乙锭和溴酚蓝点样缓冲液。还可以含有PCR反应管。本专利技术试剂盒的优化反应条件的优化过程 (1)引物浓度优化将引物浓度选择在0. 1 0. 5 μ M进行PCR扩增试验，结果表明这几个浓度的引物都能扩增出目的条带，并且当每条引物量以20pmol/ μ L，即0. 2 μ M时效果最佳。(2) MgCL2 浓度优化设置Mg2+浓度范围为1. 5 5. OmM,结果表明此浓度范围内的Mg2+都能扩增出目的条带，并且当Mg2+浓度为2. OmM时，扩增效果最好，不仅无非特异性，而且扩增条带也很明亮清晰。(3) dNIPs浓度的优化以终浓度为50 400 μ mol/L的4种等浓度的dNIPs进行PCR扩增，结果此浓度范围内的dNIPs均能扩增出目的条带，并且当总dNIPs浓度为200 μ mol/L时为最佳。(4) Taq DNA聚合酶浓度的优化以终浓度为0. 01 0. IU/ μ L的Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，结果此浓度范围内的 dNTPs均能扩增出目的条带，并且当Taq酶终浓度为0. 05U/ μ L时为最佳。(5)反应程序的确定对PCR反应的循环数10、20、30以及退火温度50°C 60°C进行PCR扩增，结果循环数在30退火温度为55°C时扩增效果最好。本专利技术的PCR试剂盒检测兔粘液瘤病毒的方法，步骤如下1、样品的预处理取检测的样品，加入600μ L灭菌的生理盐水充分洗涤样品得到含有病毒的悬液；2、样本DNA提取将上述样品反复冻融后，然后加入DNA裂解液，37°C水浴孵育 30min ；孵育好取出加入等体积的平衡酚(pH 8. 0)，上下颠倒混勻，12000rpm离心5min，取上清，如果蛋白含量高，可以再加平衡酚重复抽提一次；上清中加等体积的酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇分别抽提一次，取上清；在上清中加1/10体积的3mol/L NaAC(pH 5. 2)， 2. 5倍体积的冷的无水乙醇，_20°C放置池或过夜；取出后，12000rpm离心15min，弃上清， 75%乙醇洗一次；自然晾干后，将提取物溶解于10 μ L超纯水，作PCR模板备用。3、PCR 扩增(1)按照扩增数η(η=样品数+2)取PCR反应液，Taq酶混勻于一离心管中，按每管分装 盖上菅盖备用ο(2)先将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应的反应管中，最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置PCR仪上。(3)PCR 扩增程序95 °C预变性 5 min 后，95 °C变性 1 min，55 °C复性 1 min，72 °C延伸1 min，如此进行30个循环；最后72 °C延伸10 min,同时应设立阳性和阴性对照；4、PCR扩增产物分析取5-10μ L扩增后的样品，采用1. 2-1. 5%的琼脂糖凝胶中，120-150V下电泳30-40分钟后在0. 5-1 μ g/mL的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观察，如果阳性孔有1000 bpDNA 条带而阴性孔无的情况下，样品本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种兔粘液瘤病毒ＰＣＲ检测试剂盒，其特征在于它含有：（１）、ＤＮＡ裂解液；（２）、ＰＣＲ反应液，其含有终浓度各０．１－０．５μＭ的特异性引物：Ｍ１５０Ｒ－１： ５＇－ ａｔｇｇｃｔｔｔｔｇ ａｃｃｃｇｃｔａｃａｃｇａｇ－３＇Ｍ１５０Ｒ－２： ５＇－ ｃａｔｔｔｇｃｃｇｔ ｃｇｔａｃａｔｇａｔａｔｃｔ－３＇ （３）、兔粘液瘤病Ｍ１５０Ｒ基因的阳性质粒ｐＴＭ１５０Ｒ（４）Ｔａｑ酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜焱，张敬友，张睿，王凯民，张扬，陈国强，唐泰山，张常印，
申请(专利权)人：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：84
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