本发明专利技术提供了一种重组猪α-干扰素的制备方法，其是采用常规的PCR方法获得猪α-干扰素基因编码区，将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A中，电转化毕赤酵母菌，筛选高抗性转化子，实现重组蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，并得到具有抗病毒活性的重组蛋白。本发明专利技术通过优化毕赤酵母表达系统，提高了重组蛋白的抗病毒活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程利用，具体地说，涉及一种重组猪α -干扰素的制备方法。
技术介绍
干扰素是动物中目前所知出现最早、作用最快的第一抵御病毒体系。已对人和鼠的干扰素进行了深入研究，但对于猪的干扰素研究相对较少。猪α干扰素是由10多个相关功能基因编码的蛋白质家族，猪α干扰素亚型与猪 ω干扰素亚型之间有高度的同源性。天然猪α干扰素常常是猪α、ω干扰素功能基因表达产物的混合体。成熟的猪α-干扰素由166个氨基酸组成，诱导其分泌表达的信号肽由 23个氨基酸组成。猪α干扰素无内含子，与人α干扰素基因的同源性最高。由于猪的病毒性疾病种类多、危害大，因此发展具广谱抗病毒效应的猪干扰素具有重要意义。但干扰素的传统提取方法产量低、操作繁琐，很难推广应用，因而寻找一种高效生产干扰素的方法成为亟待解决的问题。毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统，可胞外表达外源蛋白。相比于大肠杆菌等原核表达系统，它具有完整的蛋白表达、加工和修饰功能， 而与杆状病毒、哺乳动物细胞相比，它又具有培养成本低、产量高、便于产物的分离纯化等优点。近年来，甲醇营养型酵母表达系统的研究得到迅速发展，此系统具有高表达、高稳定、 高分泌的特点，其宿主菌毕赤酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大，利于下游分离纯化操作，能大规模发酵生产，是一种适宜表达外源基因的真核表达系统。
技术实现思路
本专利技术旨在克服传统获得干扰素方法的不足，提供一种能够高效外源表达重组猪 α-干扰素的真核表达系统。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种重组猪α -干扰素的制备方法，其是将猪 α-干扰素基因克隆至载体ΡΗΒΜ905Α中，并在毕赤酵母中进行诱导表达。其中，诱导表达的具体方法为用BMGY液体培养基进行菌体的扩增培养，28-30°C，280-300rpm摇床培养至 OD600 = 20-30 ；离心取菌体，转接到BMMY液体培养基中，25j8°C，280-300rpm摇床培养，每隔24h补加甲醇至终浓度为0. 5-1 %。本专利技术的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。1、毕赤酵母重组表达载体的构建及筛选首先将载体PHBM905A用CpoI和NotI双酶切后检测回收，猪α -干扰素基因经PCR 扩增，回收的目的片段用T4DNA聚合酶处理，将处理后的片段和载体连接，经验证得到插入正确的重组毕赤酵母载体。将重组毕赤酵母载体经MlI部分酶切回收后即可进行毕赤酵母的转化。挑取转化子单菌落到BMGY平板上培养48小时，然后再点接到含有底物的BMMY平板上，甲醇诱导(每块平板每M小时补加250 μ 1甲醇)，通过单菌落在平板上产生的水解圈的大小来筛选重组毕赤酵母。2、猪α-干扰素基因在毕赤酵母中的诱导表达根据重组毕赤酵母在功能平板上的筛选，依据水解圈的大小，将有大的水解圈的重组酵母转化子进行摇瓶培养。首先用BMGY液体培养基进行菌体的扩增培养，30°C连续培养48小时左右。离心取菌体，转接到BMMY液体培养基，25°C培养，每隔24h补加100%甲醇至终浓度为1 %，每隔24h取ImL进行SDS-PAGE分析表达水平。3、活性检测在毕赤酵母中进行诱导表达，每1 取样一次，离心取上清，检测活性。从第一天到第四天，绘制诱导时间和活性大小的关系图。4、发酵工艺将酵母克隆划线接种到平板上培养，挑取菌落培养，在无菌条件下取样检测，镜检无杂菌即可作为菌种。将种子菌种接种培养基培养，添加甲醇至终浓度为 0.5%，在不同的培养时间检测其生物活性，处理菌液提取猪α-干扰素原液。5、猪α -干扰素对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的防治试验进行动物实验以检测猪α-干扰素在预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征中的作用。本专利技术采用常规的PCR方法获得猪α _干扰素基因编码区，克隆入毕赤酵母分泌型表达载体中，电转化毕赤酵母菌，筛选高抗性转化子，实现重组蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，并得到具有抗病毒活性的重组蛋白。另外，本专利技术通过优化毕赤酵母表达系统，提高了重组蛋白的抗病毒活性。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1毕赤酵母重组表达载体的构建1)引物的设计与合成应用DNAstar基因分析软件，参照NCBI genbank上的猪α -干扰素基因成熟肽核苷酸序列(ΑΥ331298)，人工合成基因序列并应用软件设计扩增猪干扰素基因的特异性引物，引物首末为酵母表达载体PHBM90fe连接位点(下划线部分)。引物序列(5’-3’)如下1:GTCAATGTGTGATTTGCCACAAACCCATTCACTTGCTCACACTAGAGC2:ATTCTTCTCATCTGAGCCAACAGTCTCAAAGCTCTAGTGTGAGCAAGT3TTGGCTCAGATGAGAAGAATTTCTCCATTTTCTTGTTTGGATCATAGA4 CTTCATGTGGAGAACCGAAATCTCTTCTATGATCCAAACAAGAAAATG5 TCGGTTCTCCACATGAAGCTTTGGGTGGCAACCAAGTTCAAAAGGCCC6GCAACATTTCGTGAACCAAAGCCATAGCTTGGGCCTTTTGAACTTGGT7TTGGTTCACGAAATGTTGCAGCAAACTTTCCAATTGTTTTCTACTGAA8:ATTCATCCCATGCAGCAGCAGAACCTTCAGTAGAAAACAATTGGAAAG9CTGCTGCATGGGATGAATCTTTGTTGCATCAATTTTGTACAGGTTTGG10:AGCTTCCAAGTCACGTAATTGCTGGTCCAAACCTGTACAAAATTGATG11:ATTACGTGACTTGGAAGCTTGTGTTATGCAGGAGGTTGGATTGGAAGG12:AAAATAGAATCTTCCTCCAACAATGGAGTTCCTTCCAATCCAACCTCC13 TGTTGGAGGAAGATTCTATTTTGGCTGTTAGGAAGTATTTTCATAGAT14 :ACTTCTCTTGCAGGTACAATGGCAATCTATGAAAATACTTCCTAACAG15 :ATTGTACCTGCAAGAGAAGTCTTACTCTCCATGTGCCTGGGAAATTGT16 :GAAGAAAAAACTCTCATAACTTCAGCTCTAACAATTTCCCAGGCACAT17 :TGAAGTTATGAGAGTTTTTTCTTCTTCCACTAACTTACAAGACAGATT18 :GGCCATTATTCCTTCTTTCTCAATCTGTCTTGTAAGTTAGTGG2) PCR合成猪α -干扰素基因通过PCR扩增以下反应体系，PCR加样如下引物11 μ 1 (IOmM)，引物 181 μ 1 (IOmM),引物 2 17 各 1. 5 μ 1 (ImM), dNTP 4 μ 1 (2. 5mM), 5X PS 缓冲液 10 μ 1， I^rimestar (TaKara 公司)0.5 μ 1，无菌水 10 μ 1，无需模板。PCR反应条件98°C变性10s，55°C退火15s，72°C延伸lmin，30个循环后，72°C延伸l本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种重组猪α－干扰素的制备方法，其特征在于，其是将猪α－干扰素基因克隆至载体ｐＨＢＭ９０５Ａ中，并在毕赤酵母中进行诱导表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘美，赵宝凯，廖峰，马立新，余晓岚，
申请(专利权)人：北京伟嘉人生物技术有限公司，北京黑金刚农业有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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