本发明专利技术公开了一种以pGAP为启动子，以毕赤酵母GS115为工程菌，在发酵罐中发酵表达肠三叶因子的工艺方法，首先构建重组毕赤酵母表达载体pGAPZɑA-ITF并转化到大肠杆菌Top10中扩增，提取大肠杆菌质粒线性化后转入酵母菌GS115中，根据载体上所带的zeocin抗性基因筛选高拷贝转化子并进行组成性表达，筛选高表达中试工程菌在培养基中发酵2天分泌表达ITF；通过纯化处理得到纯度95%以上的目的蛋白ITF，产量约为200mg/L，收率约50%；本发明专利技术生产成本低，发酵周期短，纯化方法简单，无需甲醇诱导，蛋白表达量高，为ITF的大规模工业化生产奠定了良好的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和工程领域，特别涉及肠三叶因子的制备方法。
技术介绍
肠三叶因子(以下简称ITF)是分布于肠道的特异小分子蛋白，分子量约6 7kD。 ITF由59个氨基酸残基构成，包含一个由38 39个氨基酸残基组成的特定序列，其中的6 个半胱氨酸以1 一 5，2 — 4，3 — 6的顺序依次形成3个二硫键，从而产生特异而稳定的三叶结构。这种稳定的结构确保其在肠道中发挥活性，不受消化酶和PH变化的影响。正常情况下，ITF分布于整个小肠，特别是小肠绒毛环状细胞的基底部。ITF在体内以20%单体和 80%二聚体的形式存在，但只有二聚体才具有生物活性。ITF不仅能促进肠上皮细胞增殖和移行，还能同粘蛋白中的寡聚糖或多糖的侧链相连，稳定肠粘液层。因此，ITF对肠道的保护作用非常强，它在治疗由各种致伤因子引起的胃肠粘膜损伤等方面具有显著效果。“Characterization of human and rat intestinal trefoil factor produced in yeast” 一文公开了肠三叶因子在酵母中的表达方法，该方法是利用第一代酿酒酵母发酵获得重组肠三叶因子。但它存在的缺陷是它由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降，原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降， 导致了产量的降低，仅为48mg/L ；它的纯化方法烦琐，操作复杂、步骤较多。美国专利US 20020052483A1公开了应用真核表达载体(如pMAMneo)，在COS细胞、CHO细胞等真核细胞中表达或直接从肠粘膜中提取肠三叶因子。但按照它所介绍的方法具有以下不足1.利用真核细胞表达获得肠三叶因子，虽然蛋白活性尚好，但成本较高、产量低，难以大规模生产； 2.利用肠粘膜提取肠三叶因子，虽然可以得到天然的肠三叶因子，但其原料(肠粘膜)来源受限，产量非常低，不能用于工业化大规模制备。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种重组表达载体，该重组表达载体可以保证工程菌在后续发酵中有较高的表达量，且无需借助甲醇诱导。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为肠三叶因子重组表达载体，所述肠三叶因子重组表达载体为如SEQ ID NO: 1所示的DNA 片段与PGAPZaA载体连接而成。进一步，所述肠三叶因子重组表达载体含有如SEQ ID N0:2所示的启动子核苷酸序列；进一步，所述肠三叶因子重组表达载体携带zeocin抗性基因； 进一步，所述肠三叶因子重组表达载体为由RT-PCR扩增出的如SEQ ID N0:1所示的 DNA片段，经EcoRI和NotI双酶切，然后与经EcoRI和NotI双酶切的pGAPZaA载体连接而成的重组表达载体；进一步，所述肠三叶因子重组表达载体含有组氨酸标签基因。本专利技术的目的之二在于提供一种工程菌，该工程菌能分泌肠三叶因子的，且性质稳定。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为 含有所述的肠三叶因子重组表达载体的工程菌。进一步，所述工程菌为含有重组酵母表达质粒pGAPZaA-ITF的酵母菌；进一步，所述工程菌为经100-300 μ g/ml的zeocin抗性梯度法筛选后或/和再经TCA 沉淀法筛选后所得的工程菌。本专利技术的目的之三在于提供一种制备肠三叶因子的方法，该方法产量高，成本低， 适用于工业生产。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为运用所述工程菌制备肠三叶因子的方法，将所述工程菌连续发酵不低于2天，收集发酵液，所述发酵液含有肠三叶因子。进一步，将所述工程菌连续发酵不低于2天，收集发酵液，对发酵液进行浓缩和去杂质后，得肠三叶因子；进一步，将发酵液离心后取上清液通过中空纤维柱过滤，得过滤液，对过滤液浓缩并沉淀后，用镍离子柱对带组氨酸标签的蛋白进行亲和层析分离纯化，浓缩后得肠三叶因子。进一步，将所述工程菌种子液在发酵罐内BSM培养基中发酵表达不少于2天，收集发酵液，所述发酵液中含有肠三叶因子。本专利技术的有益效果为(1)目的基因整合稳定，易于筛选高表达工程菌；(2)表达产物分泌到胞外，蛋白活性更高且利于纯化；(3)易于进行高密度发酵，表达产量高，适于大规模工业生产；(4)pGAP和pAOXl相比无需甲醇诱导，避免了甲醇污染和火灾隐患(5)表达的蛋白具有更好的生物活性，对宿主菌无毒(6)组成型表达，使用单一碳源，无需诱导，发酵方式简单；(7) pGAP表达量和pAOXl不相上下。按照本专利技术表达方法获得的重组肠三叶因子，表达产量可达200mg/L，提纯纯度可达95%或更高，纯化的蛋白产物经检测结果表明用本专利技术表达方法获得的重组肠三叶因子为高纯度、无热源、无内毒素，有正确的分子量，与天然的肠三叶因子有相同的等电点、氨基酸序列和紫外光谱，及其完好的生物学活性的重组蛋白。将其应用于治疗由各种致伤因子引起的胃肠粘膜损伤疗效明显。附图说明图1是酵母表达载体构建技术路线示意图2是重组质粒pGAPZaA-ITF酶切电泳图，1为DL2000 ；2为双酶切；3为单酶切；4为 λ DNA+Hind III ；图3是重组质粒pGAPZaA-ITF测序结果图4是重组酵母GS115-pGAPZaA-ITF基因组PCR电泳图，1为DL2000，3，4为目的基因ITF ；图5是工程菌组成性高表达筛选电泳图，1为蛋白分子量marker，5为最高表达的工程菌株图6是表达纯化的ITFU%SDS-PAGE电泳图，其中1为蛋白marker，2为纯化ITF ；图7是中试表达纯化的ITF2倍倍比稀释western-blot图，其中1为ITF原液，2-5为依次2倍稀释液；图8是AKTA explorer 50ml镍离子柱纯化ITF图9是细胞划痕实验显示的不同浓度重组人ITF促进细胞移行图，其中A为对照组 (0 μ g/ml)，B 为 25 μ g/ml 组，C 为 50 μ g/ml 组；图10是Transwell实验显示的不同浓度重组人ITF促进细胞移行图； 图11是重组人ITF减轻灌胃乙醇小鼠胃粘膜损害图；其中，A 正常对照组，B:灌胃乙醇Mi组，C =ITF治疗组。图12是重组人ITF减轻烧伤小鼠胃粘膜损害图，其中，A 正常对照组，B 烧伤 24h组，C :ITF治疗组。具体实施例方式下面将结合具体实施例，进一步阐述专利技术。应当理解的是，这些实施例仅用于说明本专利技术而不限于本专利技术的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，本文表述的浓度均为质量体积浓度。本申请人曾申报了 ITF摇瓶表达的相关专利，2008年获得授权，其采用GS115酵母菌合成重组人肠三叶因子的工艺，启动子为PPIC，授权号ZL 2005 10057295.7.本次申请的专利中使用了不同的表达启动子PGAP，二者均为真核表达系统常用的表达启动子。相比之下，PPIC在外源蛋白表达过程中需用甲醇诱导，并且发酵过程中需更换培养基进行不同培养基分批发酵，使整个实验过程操作繁琐，增加了污染的可能，同时使用的诱导剂和碳源为极易带来火灾隐患和后期纯化污染的甲醇，大大增加了发酵和蛋白纯化的工艺困难，不利于外源蛋白的工业化生产本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．肠三叶因子重组表达载体，其特征在于：所述肠三叶因子重组表达载体为如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的ＤＮＡ片段与ｐＧＡＰＺɑＡ载体连接而成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：彭曦，金星，万千雪，吴丹，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：85
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