一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用。所用菌株枯草芽孢杆菌WEI-2分离自60日龄健康仔猪粪便，能够耐受低pH环境和高浓度猪胆盐，在胃肠消化液中长时间保持活性，分泌高活性淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶，对大肠杆菌、沙门氏菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直径达到20-30mm。经过发酵后，与载体混合再利用喷雾干燥获得干燥活性菌粉，经载体稀释后获得饲料添加剂产品。该添加剂适合畜禽养殖全程使用，可以提高畜禽生产性能，促进畜禽生长，增强畜禽机体免疫力，降低幼龄动物死亡率，降低粪便排泄量，减少粪臭，改善养殖环境。

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和在畜禽养殖中的应用，尤其适用于畜禽饲料添加剂，属于饲用微生物添加剂
。背景介绍抗生素在畜禽产品中的长期使用带来的畜禽类产品的食品安全性问题已经越来越受到人们的关注，因为长期、大量使用抗生素、抗菌药物抑制病原菌的同时，动物肠道的正常菌群也受到抑制，动物肠道微生态平衡被破坏，耐药性、药物残留等问题给动物和人类的健康带来了巨大的威胁和危害，所以寻求有效、安全、绿色、天然的饲用抗生素替代产品，成为了畜禽养殖行业关注的热点问题。微生态制剂是一种天然的活性微生物制剂，具有无毒、无抗药性、无残留、无副作用的特点。近年来，微生态制剂对于动物肠道微生态平衡的调节作用和提高动物机体免疫力，进而提高养殖动物的健康水平和生产性能的功效已经得到人们的普遍认可，是公认的饲用抗生素的最佳替代品之一。枯草芽孢杆菌是农业部《饲料添加剂品种目录》所列菌种，是微生物饲料添加剂的常用菌种。枯草芽孢杆菌对人和动物没有毒性，在生长过程中可以产生高活性的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，能够促进畜禽对饲料的消化利用率；能够产生抑菌代谢物，抑制肠道病原菌的生长；该菌是严格好氧细菌，进入肠道后通过生物夺氧的作用为肠道乳酸菌类和双歧杆菌类厌氧微生物提供厌氧环境从而促进有益菌的生长，调节肠道微生态平衡。因此，筛选一株性能优良的枯草芽孢杆菌，并开发出低成本、高产量，能长期保持活性的菌粉产品，对于发展绿色饲料，保证食品安全具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WE1-2CGMCCN0.7744。从健康仔猪粪便中分离、筛选得到一株芽孢杆菌，经16S rDNA测序鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为WE1-2，并于2013年6月19日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC N0.7744，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所邮编:100101电话:86-10-64807596。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) WE1-2CGMCC N0.7744属革兰氏阳性细菌，杆状，芽孢中生或偏中生，孢囊膨大但不显著，7%氯化钠中生长，pH5.7生长，可利用阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸，可利用葡萄糖和柠檬酸盐，水解淀粉，液化明胶，硝酸盐还原试验为阳性，V-P测定为阳性。生长温度范围在30-40°C，适宜pH值的范围7.0-8.0，是严格好氧菌。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) WE1-2CGMCC N0.7744 在 pH 为 2-3 的人工胃液中保持3h，存活率90%;在人工胃肠消化液中保持26h，活菌数可以维持在IO8CFU / mL,这个时间符合肠道生理周期，能够保证菌体发挥益生作用；在猪胆盐浓度为20g / L的人工猪胆盐溶液中，保持3h，存活率为75%，这个胆盐浓度远远高于动物体内的0.3g / L的平均胆盐浓度。上述特性评价试验中，所述人工胃液包括如下成分:每1000mL水中含有胃蛋白酶3g，NaC12g，用盐酸调pH至2-3 ;所述人工胃肠消化液包括如下成分:人工胃液pH调至3，人工肠液包括如下成分:每1000mL水中含有胰蛋白酶10g，KH2P047g，调pH至7.5，测试过程中，菌体在人工胃液中保持2h，然后接入人工肠液中保持24h ;所述人工猪胆盐溶液成分包括:每1000mL水中含有胰蛋白酶lg，猪胆盐20g，NaC15g，调pH至7.0。枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)WE1-2CGMCC N0.7744的发酵上清液中同时具有淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的活性，三种酶的产量分别为246U / mL，683U / mL和152.6U / mL。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) WE1-2CGMCC N0.7744对大肠杆菌、沙门氏菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直径达到20-30mm。枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)WE1-2CGMCC N0.7744是本专利技术过程中分离到的所有芽孢杆菌中生长速率和产孢速率最快，生物量和芽孢产量最高，生长稳定性最好的一株芽孢杆菌，适宜作为工业化生产菌株。该菌株在肉汤培养基中生长25h左右活菌数达到最大，为2.6 X IO9CFU / mL，生长至36h左右芽孢产量达到最高，为2.1 X IO9CFU / mL左右，产孢率大约为80%，菌株经多次传代和多次重复发酵试验，生长特性和产量稳定。本专利技术的第二个目的是提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WE1-2CGMCC N0.7744作为畜禽饲料添加剂的制备方法。所述制备方法的具体步骤如下:(I)斜面菌种的活化:从枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)WE1-2CGMCC N0.7744的保藏甘油管中挑一环菌液划线于营养琼脂平板，于32-37°C，培养15-20h，使芽孢杆菌复壮，并长出单菌落，挑单菌落划线于斜面培养基进行活化，所述斜面培养基同样是营养琼月旨，配方为:每1000mL水中含有:蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15_20g，pH值为7.2-7.4，常规灭菌。(2)种子摇瓶的制备:从上述活化好的斜面上挑一环菌种接于装有250_300mL液体种子培养基的1000mL三角瓶中，于35-37°C，振荡培养20_30h，即得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) WE1-2CGMCC N0.7744 的摇瓶种子液，活菌数为 2 X IO9CFU / mL，芽孢处于刚开始形成的状态。所述摇瓶种子培养基的配方为:每1000mL水中含有:蛋白胨20g，酵母膏10g，三水合磷酸氢二钾lg，一水合硫酸锰0.lg，pH值为7.4，常规灭菌。(3)种子罐的培养:将上述制备好的摇瓶种子液按照1% (V / V)的接种量接入装有50L种子发酵培养基的100L种子发酵罐中，于35-37°C，培养20_25h，搅拌转速为250-300rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂。得到二级种子发酵液，活菌数为3.2 X IO9CFU / mL，芽孢处于刚开始形成的状态。所述种子发酵培养基与摇瓶种子培养基的配方一致。 (4)生产发酵:将上述制备好的种子发酵液按照1-2% (V / V)的接种量接入装有2500L发酵培养基的5000L生产发酵罐中，于35-37 °C，发酵25_30h，搅拌转速为250-300rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂。发酵结束获得枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WE1-2CGMCC N0.7744的活菌发酵液，活菌数为5 X IO9CFU / mL以上，芽孢产率为80%左右。所述发酵培养基的配方为:每1000mL水中含有:蛋白胨20g，酵母膏5g，葡萄糖10g，三水合磷酸氢二钾lg，一水合硫酸锰0.15g，七水合硫酸镁0.3g，pH值为7.2。(5)发酵液后处理:发酵结束后的发酵液通过高速管式离心机富集菌体(15000-20000rpm)后转移至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为WEI‑2，保藏编号为CGMCC No.7744。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为 WE1-2，保藏编号为 CGMCC N0.7744。2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用，其特征在于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WE1-2CGMCC N0.7744作为畜禽饲料添加剂的制备方法，具体步骤如下: (1)斜面菌种的活化:从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WE1-2CGMCC N0.7744的保藏甘油管中挑一环菌液划线于营养琼脂平板，于32-37°C，培养15-20h，使芽孢杆菌复壮，并长出单菌落，挑单菌落划线于斜面培养基进行活化，所述斜面培养基同样是营养琼月旨，配方为:每1000mL水中含有:蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15_20g，pH值为7.2-7.4，常规灭菌。 (2)种子摇瓶的制备:从上述培养好的斜面上挑一环菌种接于装有250-300mL液体种子培养基的1000mL三角瓶中，于35-37°C，振荡培养20_30h，即得枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WE1-2CGMCC N0.7744的摇瓶种子液。所述摇瓶种子培养基的配方为:每1000mL水中含有:蛋白胨20g，酵母膏10g，三水合磷酸氢二钾lg，一水合硫酸锰0.lg，pH值为7.4，常规灭菌。 (3)种子罐的培养:将上述制备好的摇瓶种子液按照1%(V / V)的接种量接入装有种子发酵培养基的种子发酵罐中，于35-37°C，培养20-25h，搅拌转速为250_300rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂，得到二级种子发酵液。所述种子发酵培养基与摇瓶种子培养基的配方一致。 (4)生产发酵:将上述制备好的种子发酵液按照1-2%(V / V)的接种量接...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔琳，姚宏明，高长斌，刘蕊，金忠辉，
申请(专利权)人：北京伟嘉人生物技术有限公司，沈阳伟嘉牧业技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11