本发明专利技术公开了里氏木霉(Trichoderma?reesei)β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体、重组菌及在重组菌中的表达，构建含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体：(1)PCR扩增里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1，连接至TA载体；(2)里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1构建至巴斯德毕赤酵母表达载体；本发明专利技术重组菌能有效地表达目的蛋白里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1。克服了现有技术从里氏木霉中无法大量纯化出β-葡萄糖苷酶的不足。自然界中有诸多废弃木质纤维素，本发明专利技术的方法能提高β-葡萄糖苷酶的产量，对提高纤维素的降解效率、高效的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有极其重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体地涉及一种含里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGLl基因的重组载体、含里氏木霉β -葡萄糖苷酶BGLl基因的重组巴斯德毕赤酵母菌及里氏木霉 β -葡萄糖苷酶BGLl基因在重组巴斯德毕赤酵母菌中的诱导表达。
技术介绍
纤维素是植物细胞壁的主要成份，是地球上最大量的可再生碳源物质。利用其进行生物转化生产燃料乙醇等化学品，对于当前人类解决能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有极其重要的意义。降解纤维素的纤维素酶是一个多酶体系，包含内切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，这三种酶协同作用将纤维素降解成葡萄糖内切葡聚糖酶切断纤维素长链，产生自由的末端，外切葡聚糖酶可以结合到这些末端进一步水解；另一方面，外切葡聚糖酶的水解作用使纤维素结晶区结构变得松散，有利于内切葡聚糖酶的作用；葡萄糖苷酶降解寡糖和纤维二糖成葡萄糖。在纤维素酶水解纤维素的过程中，目前主要有以下几种问题(1)在产纤维素酶的菌株中，葡萄糖苷酶含量都很低，远达不到实际应用的水平；(2)在反应过程中，由于热抑制作用，葡萄糖苷酶的大部分活性会丧失。因此，葡萄糖苷酶的活力一般比内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶低一个数量级以上，是纤维素降解的限速酶 ]。里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种嗜温型腐生丝状真菌，在学术研究或工业生产中，都引起人们的广泛关注。它能分泌产生内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶，包含了完整的纤维素水解酶系Μ。在天然的里氏木霉中，有BGLl和BGL2两种β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶的活性低至0. 0967U/mLte]。其中BGLl相对BGL2有更强的β-葡萄糖苷酶活性。由于天然里氏木霉菌株中的葡萄糖苷酶产量很低，从而限制了纤维素的水解过程。β -葡萄糖苷酶作为纤维素水解的限速酶，在纤维素的水解过程中起着关键的作用。 如果通过构建重组菌株，提高β -葡萄糖苷酶的产量，将是实现纤维素高效降解的可行途径。参考文献赵雪娜，β -葡萄糖苷酶基因过量表达提高Trichoderma reesei纤维素降解活性，山东大学，2007.Tomme P, Warren RA, Gilkes NR. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi. Adv Microbiol Physiol,1995. 37 :1 81.王振宇，鱼红闪，金风燮.高温厌氧菌产纤维素内切酶和争葡萄糖苷酶的活性.大连轻工业学院学报，2005, ), 110 114.Penttila ME, Andre L, Saloheimo Μ, Lehtovaara P.1987. Expression of two Trichoderma reesei Endoglucanase in the Yeast Saccharomyces cereviae. Yeast, 3 :75-85.Wen ZY,Liao W,Chen SL. Production of cellulase by Trichoderma reesei from dairy manure. Bioresource Technology 96 (2005)491-499.
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供一种里氏木霉(Trichoderma reesei) β -葡萄糖苷酶基因BGLl的重组载体。本专利技术的第二个目的是提供含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGLl的重组巴斯德毕赤酵母菌。本专利技术的第三个目的是提供里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGLl在重组巴斯德毕赤酵母菌中的诱导表达。本专利技术的技术方案概述如下里氏木霉β -葡萄糖苷酶基因BGLl的重组载体，用下述方法构建(1)提取里氏木霉 CTrichoderma reesei) CICC 13052 的总 RNA，反转录成 cDNA，以该cDNA为模板，用序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR，扩增出序列表中SEQ ID NO. 3所示2235bp的里氏木霉β -葡萄糖苷酶基因BGL1， 连接至TA载体pGEM-T，获得含有里氏木霉β -葡萄糖苷酶基因BGLl的质粒pGEM_BGLl ；(2)里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGLl构建至巴斯德毕赤酵母表达载体以所述质粒pGEM-BGLl为模板，以序列表中SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 5所示核苷酸序列为上、 下游引物进行PCR扩增，获得序列表中SEQ ID N0.6所示的2198bp片段，将所述2198bp 片段连接至TA载体pGEM-T，命名为pTBGLl ；提取质粒pTBGLl和巴斯德毕赤酵母表达载体 pPICZalpha C质粒，用Cla I和XbaI同时酶切pTBGLl和pPICZalpha C质粒，经琼脂糖凝胶电泳后回收酶切PTBGLl得到SEQ ID N0. 7所示的2183bp片段和酶切pPIChlpha C得到的SEQ ID N0. 8所示的3530bp片段；回收产物连接后转化到大肠杆菌T0P10F'的感受态细胞中，涂含&0(^11 25 μ g/mL的LB平板，培养12-1^1，得到含pPICZalpha C-BGLl质粒的大肠杆菌，提取大肠杆菌中pPICZalpha C-BGLl质粒，即得到含有里氏木霉β -葡萄糖苷酶基因BGLl的重组载体。一种含有里氏木霉β -葡萄糖苷酶基因BGLl的重组巴斯德毕赤酵母菌(Pichia paSt0riS)Rl，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.4606。一种含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGLl的重组巴斯德毕赤酵母菌，用下述方法获得将10-15 μ g的权利要求1所述pPICZalpha C-BGLl质粒，用RneI酶切成SEQ ID N0. 9所示的5713bp片段，乙醇沉淀SEQ ID N0. 9所示的DNA片段，干燥SEQ ID N0. 9所示的 DNA片段后溶于无菌水，制成浓度为0. 5-1 μ g/μ L DNA的溶液；将80 μ L巴斯德毕赤酵母宿主菌Χ33的感受态细胞与IOyL的所述0. 5-1 μ g/ μ L的DNA溶液混合均勻后转移到0_4°C 预冷的电极杯中，冰浴5min，1500V电击5ms，电击后加入ImL 0_4°C预冷的IM山梨醇水溶液到电极杯中，混勻，将混合液转移到离心管中，28-30°C静置培养l_2h，在含ΙΟΟμ g/mLZeocin的YPD平板上涂50 μ L-200 μ L培养后的混合液，倒置培养至菌落出现，PCR 鉴定菌落，PCR结果为阳性的菌落，为含有里氏木霉葡萄糖苷酶基因BGLl的重组巴斯德毕赤酵母菌，选取重组巴斯德毕赤酵母菌Rl，R2，R3，R4，R8，R12进行诱导表达试验，都能有效地分泌表达葡萄糖苷酶，其中将分泌葡萄糖苷酶最高的Rl进行保藏。里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGLl在重组巴斯德毕赤酵母菌中的诱导表达，包括下述步骤①用权利要求3所述的方法获得的含有里氏木霉β -葡萄糖苷酶基因BGLl的重组巴斯德毕赤酵母菌Rl，R2，R3，R4，R8，R12和对照本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．里氏木霉β－葡萄糖苷酶基因ＢＧＬ１的重组载体，其特征是用下述方法构建：（１）提取里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＣＩＣＣ １３０５２的总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ，以该ｃＤＮＡ为模板，用序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２所示核苷酸序列为上、下游引物进行ＰＣＲ，扩增出序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３所示２２３５ｂｐ的里氏木霉β－葡萄糖苷酶基因ＢＧＬ１，连接至ＴＡ载体ｐＧＥＭ－Ｔ，获得含有里氏木霉β－葡萄糖苷酶基因ＢＧＬ１的质粒ｐＧＥＭ－ＢＧＬ１；（２）里氏木霉β－葡萄糖苷酶基因ＢＧＬ１构建至巴斯德毕赤酵母表达载体：以所述质粒ｐＧＥＭ－ＢＧＬ１为模板，以序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５所示核苷酸序列为上、下游引物进行ＰＣＲ扩增，获得序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６所示的２１９８ｂｐ片段，将所述２１９８ｂｐ片段连接至ＴＡ载体ｐＧＥＭ－Ｔ，命名为ｐＴＢＧＬ１；提取质粒ｐＴＢＧＬ１和巴斯德毕赤酵母表达载体ｐＰＩＣＺａｌｐｈａ Ｃ质粒，用Ｃｌａ Ｉ和ＸｂａＩ同时酶切ｐＴＢＧＬ１和ｐＰＩＣＺａｌｐｈａ Ｃ质粒，经琼脂糖凝胶电泳后回收酶切ｐＴＢＧＬ１得到ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７所示的２１８３ｂｐ片段和酶切ｐＰＩＣＺａｌｐｈａ Ｃ得到的ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８所示的３５３０ｂｐ片段；回收产物连接后转化到大肠杆菌ＴＯＰ１０Ｆ′的感受态细胞中，涂含Ｚｅｏｃｉｎ ２５μｇ／ｍＬ的ＬＢ平板，培养１２－１６ｈ，得到含ｐＰＩＣＺａｌｐｈａ Ｃ－ＢＧＬ１质粒的大肠杆菌，提取大肠杆菌中ｐＰＩＣＺａｌｐｈａ Ｃ－ＢＧＬ１质粒，即得到含有里氏木霉β－葡萄糖苷酶基因ＢＧＬ１的重组载体。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马媛媛，邹少兰，洪解放，张鲲，井欣，张敏华，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12
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