本发明专利技术公开了一种可识别HCV?NS5A蛋白的核酸适体，其为SEQ?ID?NO：1～SEQ?ID?NO：5中任一序列所示的DNA片段，其衍生物为包括核苷酸取代后的RNA核酸适体、骨架改造后的衍生物、改造为肽核酸后的衍生物以及连接上放射性分子后的衍生物。该核酸适体的筛选方法包括：先制备带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白，再制备带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白；然后对蛋白进行固定，并设计随机核酸文库；最后进行核酸适体的筛选，筛选过程具体又包括DNA文库预处理、反筛、正筛及反复筛选等步骤，最后获得竞争能力强、序列长度得到优化的核酸适体。本发明专利技术的核酸适体及其衍生物可用于制备丙型肝炎病毒NS5A蛋白的检测试剂盒或诊断试剂，还可用于制备抑制丙型肝炎病毒在肝细胞内复制的试剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于遗传工程
，尤其涉及一种核酸适体、核酸适体的衍生物及其筛选方法和应用。
技术介绍
丙型肝炎病毒(HCV)感染是一种危害严重的全球性健康问题，全世界已有2亿感染者。据估计，每年新增感染者数为300 400万。我国约有4000万至5000万人感染HCV， 仅次于乙型肝炎携带者数量。目前，治疗丙型病毒肝炎的标准方法是采用干扰素或者干扰素联合利巴韦林治疗。在治疗感染基因型2型和3型HCV的患者中有75% 90%的HCV根除率，然而，仍有约50%的1型和4型HCV感染的病人不敏感。虽然加入利巴韦林能够增强持久的抗病毒应答水平，但也能带来严重的副作用(如溶血性贫血)，这些副作用常常导致20%的患者中断治疗。由于HCV基因组有极大的序列差异性，加之组合疗法的副作用大和治疗价格昂贵，急需开发新方法来有效治疗不同HCV基因型感染的肝病患者。核酸适体(Aptamer)是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)从人工合成的 DNA/RNA文库中筛选得到的能高亲和性、高特异性结合生物靶标的单链寡核酸分子(ssDNA 或ssRNA)。核酸适体的靶标包括多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，识别能力与抗体分子相当甚至更强，但自身又具有许多显著优点，如分子量小、易保存、无免疫原性、容易合成标记、穿透组织能力强、化学稳定性好等，在抗病毒治疗领域具有重要的应用前景。作为一种严重危害人类健康的病毒，HCV编码约3100个氨基酸残基组成的多聚蛋白，该蛋白在宿主细胞信号肽酶和病毒蛋白酶作用下，可裂解产生10种HCV蛋白包括结构蛋白Core、El和E2、ρ7蛋白，以及非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其中，非结构蛋白NS5A的功能至今仍不十分明确，近年来的研究表明其定位于内质网膜的细胞质侧，存在基础磷酸化与过磷酸化两种形式(Ρ56和Ρ58)，过磷酸化位点为ser2197， ser2201和/或ser2204，并且含有已知的干扰素敏感性决定区域(IFN sensitivity determining region, ISDR)。越来越多的研究表明NS5A可能是影响和调控HCV复制的关键蛋白，尤其是磷酸化形式对HCV的复制有着重要的影响。Min Gao等(Min Gao, Richard Ε. Nettles, Makonen Belema, et al. Chemical genetics strategy identifies an HCV NS5A inhibitor with a potent clinical effect. Nature, 2010 ；465 :96-100)用化学遗传学方法筛选出了特异性抑制NS5A蛋白的小分子有机化合物抑制剂BMS-790052，并且该抑制剂能非常有效地抑制HCV的基因组复制。因此，以HCV NS5A蛋白作为特定靶点筛选与其特异结合的核酸适体，然后从这些特异识别靶标的核酸适体中，挑选出特异性结合NS5A 蛋白功能结构域的抑制HCV复制的核酸适体，具有非常重要的医学价值，这将为丙型病毒性肝炎及其他肝病药物的开发开辟新的途径。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能有效结合并封闭 NS5A蛋白的活性位点、进而抑制HCV复制、并具有显著抗HCV感染能力的核酸适体及其衍生物，并相应提供易于制备、成本低廉的该核酸适体的筛选方法和应用。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为一种可识别HCV NS5A蛋白的核酸适体，其为SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 5中任一序列所示的DNA片段。上述技术方案的核酸适体中，五种不同序列的DNA片段依次如下核酸适体序列1 (以下简称NS5A-1)5' -ACGTACACTAGTGGTCCGGGCGGGGCTCATTGTCC-3'；核酸适体序列2 (以下简称NS5A-2)5’ -GCGGATTGTCCATTGAACCTTCGTCAACTATGCCG-3’ ；核酸适体序列3 (以下简称NS5A-3)5’ -CACGCCAGACCAGCCGTCCTCTCTTTATCCGAGCCTTCATCCGAG-3，；核酸适体序列4 (以下简称NS5A-4)5’ -GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA-3，；核酸适体序列5 (以下简称NS5A-5)5’ -CTGGATCGAAAAGTATCCACGTTTGTCTGAAAATAGTGGC-3’。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种上述核酸适体的衍生物，该衍生物可以为以下a d中的任意一种a)将所述核酸适体进行核苷酸取代后得到的RNA核酸适体；b)将所述核酸适体骨架改造为硫代磷酸酯骨架后得到的核酸适体衍生物；c)将所述核酸适体改造为肽核酸后得到的核酸适体衍生物；d)将所述核酸适体连接上放射性分子(或者其他的肝癌治疗药物)后得到的核酸适体衍生物。需要说明的是，上述各种衍生物应当具有本专利技术所述核酸适体相类似的功能，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种上述的核酸适体的筛选方法，包括以下步骤(1)制备丙型肝炎病毒NS5A蛋白以pJFHl质粒作为PCR扩增的模板，用第一引物对NS5A基因进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用限制性酶Nde I和HindIII双酶切所述的PCR扩增产物，获得酶切产物；用限制性酶Nde I和HindIII双酶切原核表达载体 pET28b，回收载体骨架；将所述酶切产物和载体骨架连接，得到连接产物；将该连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取得到重组质粒 pET28b-NS5A ；再经过大量表达及纯化过程，制得带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白；(2)制备对照蛋白LacZ 用pET200/D/LacZ蛋白的编码基因与载体上的组氨酸标签的编码基因融合，表达带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白；再经过大量表达及纯化过程，制得带组氨酸标签的pET200/D/LacZ蛋白；(3)蛋白的固定取Ni-NTA琼脂糖微珠，经预处理后分别分散于步骤(1)制得的带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS5A蛋白和步骤( 制得的带组氨酸标签的pET200/D/LacZ 蛋白中，经孵育、洗涤后分别得到固定有靶标蛋白的微珠和固定有对照蛋白的微珠；(4)随机核酸文库的设计设计两端包含20个核苷酸、中间包括40个核苷酸的随机核酸文库如下5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG(N40)CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，；其中，N40 表示40个随机核苷酸；(5)核酸适体的筛选A)DNA文库预处理将步骤(4)设计的随机核酸文库溶于结合缓冲液中；B)反筛将步骤C3)制得的固定有对照蛋白的微珠与所述预处理后的随机核酸文库混合，孵育、洗涤后再进行超滤离心；C)正筛将上述超滤离心后的溶液与步骤C3)制得的固定有靶标蛋白的微珠混合，经过孵育、洗涤后转移微珠，再将转移后的微珠进行加热、冷却和离心，收集上清，以上清液中的DNA为模板并利用生物素标记的第二引物对进行PCR扩增，扩增后通过亲和素包被的葡本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种可识别ＨＣＶ ＮＳ５Ａ蛋白的核酸适体，其为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５中任一序列所示的ＤＮＡ片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱海珍，方晓红，杨大荣，徐丽，刘斌，雷少华，刘念礼，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：43
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